外泌体在过敏性疾病中的研究进展

吕婷 刘东璞 盛延良 薛超 彭玲 卢凤美

(佳木斯大学基础医学院微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室，黑龙江 佳木斯 154007)

过敏性疾病因其复杂的发病机制和临床表现对于临床医学的诊断、治疗及法医学鉴定方面都是急需解决的一项难题。外泌体是一种大小为30～150 nm的双层膜囊泡。其强大的细胞通讯功能可直接影响下游细胞功能及生物学特性，在固有免疫应答中Toll样受体(TLR)调控、转录调节及调控上皮间质转化外泌体在过敏性疾病中都发挥不可磨灭的作用。过敏性疾病在全球目前呈持续增长的趋势，自2000年以来，食物过敏、嗜酸性食管炎和药物性过敏反应的流行率已上升到流行病的比例〔1〕。不同疾病释放的外泌体含量及特异性遗传信息也不尽相同〔2〕。在过敏性疾病中，外泌体释放数量各有差异，外泌体内携带的物质信息亦有区别。本文主要论述外泌体的基本特征及其在过敏性疾病的作用。

1 外泌体概述

1.1外泌体发现 1983年，学者在绵羊的网织红细胞中首次发现外泌体的存在，刚开始人们都认为外泌体是人体的一种没有任何作用的排泄物，并未过多关注〔3〕。后来发现它是有功能的，主要参与物质之间的信息传递交流及信号转导等，随后1987年被命名为外泌体。外泌体几乎被除成熟红细胞外的所有细胞释放，在人体血液〔4〕、尿液〔5〕、唾液〔6〕、支气管肺泡灌洗液(BALF)〔7〕中均可检测不同含量外泌体。

1.2外泌体释放机制和功能 外泌体释放机制主要为两种：(1)细胞膜外部分子内化形成核内体，晚期核内体通过核内体膜进一步内出芽变为一个小的囊泡(ILV)，随之形成许多囊腔内多囊体即多泡体( MVBs)。(2)内分体分类复合体(ESCRT)独立出芽〔8〕，ESCRT由30种蛋白质组成，其中包含4种功能亚复合物，ESCRT-0亚复合物分隔泛素化的蛋白TSG101和 VPS4B，ESCRT-Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ直接辅助ILVs出芽，而液泡蛋白分选因子复合物Vps4确保了最终的膜断裂和(或)ESCRT循环，最后辅助因子凋亡连锁基因2相互作用蛋白(ALI)X将膜蛋白分成囊泡，囊泡随后出芽成MVBs〔9〕。整个ESCRT通路过程是ATP酶依赖的，它通过酶作用完成膜脱落〔10〕。MVBs最终与细胞膜融合，此时多泡体内物质被释放入外部环境中，即外泌体。外泌体主要作用：(1)疾病的诊断，其携带丰富的信息及外部双层膜结构，可有效避免囊泡内物质被破坏。外泌体存在于各体液中，易于获取。Jin等〔11〕在腺癌(AC)和鳞状细胞癌(SCC)患者研究中发现，AC患者外泌体内miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p与健康志愿者相比显著增高(P<0.05)，SCC患者外泌体中miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b特异性强，有助于AC和SCC诊断。(2)参与细胞间通讯，构建新的物质传输载体通路，是携带药物适合的载体。外泌体分子结构小，生物相容性高，可携带核酸、蛋白质和脂质等。Tian等〔12〕研究表明静脉注射靶向外泌体能将阿霉素特异性输入肿瘤组织中，能抑制肿瘤生长且未表现出明显毒性。(3)疾病的治疗靶点，将不同细胞来源的外泌体作为治疗靶点治疗疾病。Kordelas等〔13〕实验证明将间充质干细胞(MSCs)来源的外泌体用于移植物抗宿主病治疗发现患者对外泌体的重复注射耐受性良好，不仅没有实质性的副作用，还可减轻患者临床症状。

1.3外泌体的提取及鉴定 目前外泌体的提取主要是使用离心法，首先用低速离心除去液体中的大质量蛋白，然后采取超高速离心法便可分离出大小均匀的外泌体，该方法可以得到较纯净的外泌体。该方法操作较麻烦，提取率相对较低，目前仍是主要使用的方法。试剂盒(Invitrogen、Exo-spinTM)等提取外泌体更高效快捷，未来可能替代离心法成为一种新的趋势。鉴定外泌体可在投射电镜下观察外泌体形态均匀多呈杯状或盘状、大小一致，均为30～150 nm，也可以通过外泌体表面特异性采用标记蛋白经蛋白印迹技术，可见CD63、CD9、CD81等高表达。纳米粒子追踪分析亦可对外泌体进行定量分析，且能更好减少外泌体结构被破坏〔5〕。

2 外泌体与过敏性疾病

2.1外泌体与变态反应性鼻炎(AR) 特异性个体接触过敏原后，引起各种免疫活性细胞与细胞炎性介质共同参与的鼻黏膜慢性非感染性炎症即过敏性鼻炎，且这一过程是由IgE介导的〔14〕。IgE与肥大细胞表面受体结合导致辅助性T细胞Th1/Th2平衡失调，Th2释放促炎介质白细胞介素(IL)-5、IL-4等引起过敏反应。Zhu等〔15〕在AR 患者鼻腔黏液和用卵清蛋白(OVA)刺激的鼻腔上皮细胞培养实验中不仅发现鼻腔黏液中可分离出外泌体，还可见长链非编码RNA生长停滞特异性转录本(LncGAS)5高表达。研究结果表明上皮来源外泌体LncGAS5部分通过下调转录调节因子T-bet和Zeste Homolog2的增强子(EZH)2来介导Th1/Th2的分化，主要是抑制Th1分化，促进Th2分化，由此可见lncGAS5 是介导 Th1/Th2 细胞分化的不可缺少的介质，这项研究也表明外泌体在AR中的关键介质作用。Wang等〔16〕在鼻炎患者鼻黏膜检测中发现，相对健康测试者AR患者鼻黏液中高表达外泌体lncRNA核旁斑点组装转录本(NEAT)1，而NEAT1表达与鼻炎的严重程度相关,这一过程主要是通过调节microRNA-511/核受体亚家族4A组成员(NR4A)2轴而实现的。Wu等〔17〕在IgE水平升高的脐带血和AR儿童鼻黏液提取到的外泌体中发现miR-21和miR-126水平显著降低。随后将miR-21前体转染到单核细胞中抑制了转化生长因子(TGF)β受体(TGFBR)2的表达，可见miR-21在调节TGFBR2中发挥作用。而TGFBR2在之前的证据表明可能是抑制IgE产生的代偿机制〔18〕。除此之外，Fang等〔19〕实验证明人间充质基质细胞的小细胞外泌体可通过传递miR-146a-5p来减轻第2组先天淋巴样细胞显性的过敏性气道炎症，包括过敏性鼻炎、支气管哮喘(BA)等。

2.2外泌体与BA 哮喘是最普遍的慢性呼吸道疾病之一，影响着世界上近3亿人〔20〕。在对中国北京2010～2011年14岁以上哮喘患者流行病学调查显示，哮喘的发病率为1.19%，且有增加趋势〔21〕。

2型细胞驱动气道炎症引起哮喘发生，特异性病理表现主要为气道内嗜酸性粒细胞和肥大细胞,还有中性粒细胞及各种炎细胞浸润。目前哮喘的治疗目标仍然控制症状和炎症因子以避免病情恶化。Mazzeo等〔22〕研究发现与健康者相比，哮喘患者嗜酸性粒细胞可以释放的外泌体数量更多,且对哮喘发病及病情严重程度可能有作用。嗜酸性粒细胞分泌的外泌体导致气道黏液分泌增多，小气道的痉挛还能反作用于嗜酸性粒细胞释放更多外泌体，而气道高反应性的增加也是其分泌的外泌体通过活化及增强促炎因子的聚集和释放达到的。Du等〔23〕研究证实间充质干细胞源外泌体可以上调哮喘患者外周血单核细胞M2 样表型中的TGF-β1和 IL-10 来刺激调节性T细胞(Tregs)增殖和分泌从而发挥抗炎作用，而这一反应可能是通过抗原递呈细胞的内化而实现的。外泌体可以携带体内各遗传物质随着体液及胞吞胞吐作用转运至相应靶细胞发挥作用，从而有助于哮喘的治疗。其中哮喘患者BALF中miRNA-449已经被发现可以调节气道纤毛细胞的分化，促进中心粒增殖和多纤毛发生，部分是通过靶向NOTCH1mRNA发挥作用的〔24〕。研究发现哮喘患者的BALF外泌体中存在大量的白三烯(LTs)C4合酶(LTC4S)，而超敏反应释放的炎症因子LTs途径被证明存在于外泌体，是LTs生物合成酶的载体，改变毛细血管和微静脉血管通透性，引起哮喘发生外泌体的半胱氨酸(cys)LT代谢能力同时也增强了外泌体特异性释放的具有更强大信使功能的纳米囊泡〔25〕。在重型哮喘的研究中，Haj-Salem等〔26〕发现严重哮喘患者的成纤维细胞中释放的外泌体中TGF-β2增强，导致上皮细胞增殖减少，而下调TGF-β2则增强上皮细胞增殖，在严重哮喘患者外泌体检测中证实TGF-β2明显低于健康者，此项实验亦证明外泌体中至少部分促进气道重塑。严重的类固醇抗性哮喘(SSRA)患者由于抵抗类固醇激素导致治疗效果极差，生活质量严重恶化。Dong等〔27〕发现间充质干细胞来源外泌体(MSC-Exo)处理对巨噬细胞极化、核因子(NF)-κB和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的影响依赖于肿瘤坏死因子相关因子(TRAF)1，通过抑制TRAF1来重塑巨噬细胞的极化，调整炎症从而可改善SSRA。

2.3外泌体与过敏性接触性皮炎(ACD) ACD是一种由接触皮肤的各种物质的免疫反应引起的皮疹〔28〕。其发病率尚未明确定义，但其发病率一直被认为是持续增加的，常见的相关过敏原包括羊毛脂、甲醛、倍半萜内酯混合物及ACD患者个人护理用品中各种成分。ACD临床表现多样而复杂，症状轻微的ACD常使人心情烦躁，严重时还会影响患者日常生活，甚至工作能力，由此引起的一些民事医疗索赔案件也占有一定比例〔29〕。此外，ACD很少单独存在，常伴随AR、过敏性哮喘等其他过敏性反应同时存在。角质形成细胞是皮肤最外层保护屏障,角质形成细胞排列紊乱，角质层呈网篮状是ACD常见病理变化,有学者在ACD患者血液中提取超出正常人群数量的外泌体,通过电镜观察出外泌体的大小,用二代基因测序发现最具差异表达的miRNA-150-5p，然后将不同浓度的外泌体与角质形成细胞共同培养发现不同浓度的培养皿中可检测到炎症介质IL-33、趋化因子CXCL1、CXCL2不同程度上调，而间充质来源外泌体可通过抑制促炎因子表达，增强抗炎因子表达从而发现治疗ACD可行靶点〔30〕。此外，外泌体中miRNA-150-5p还可在ACD中参与各种通路的表达,靶向作用于人高迁移率族ATHook蛋白(HMG)2基因，促进角质形成细胞增殖、细胞活化及炎症发生〔31〕。

2.4外泌体与过敏性休克(AS) AS是一种严重的、快速发展的、可能致命的全身反应。接触过敏原后，触发机体发生反应，引起肥大细胞脱颗粒释放出许多影响血管通透性、血管平滑肌张力和支气管的炎性介质及细胞因子(LTs、C3a、C5a)等，激活全身炎症级联放大反应，从病理生理学角度来看，这一机制主要是IgE与受体(FcεRI)结合介导的。另一机制主要由巨噬细胞、嗜碱粒细胞和中性粒细胞等与FcγRⅢ结合诱导特异性过敏反应，即非IgE依赖的过敏反应〔32〕。不论是经过哪一途径，作为过敏性疾病最严重的疾病发展，其中损害最严重的就是循环呼吸系统，引起血管扩张，痉挛、器官组织处于充血状态导致大量体液流失出现休克症状。如果没有及时发现救治患者很快死亡，由此可引起一系列医疗纠纷和死亡鉴定困难等问题。而外泌体作为信息通路的传播载体，在AS发病机制、诊断及治疗中起十分重要的作用。TLR作为机体保护性的免疫哨兵，能够感应与病原体相关的分子模式，识别损伤细胞分子及内源性配体，介导炎症的发生。一方面外泌体可通过TLR2调控固有免疫，扩大TLR2对病原体的识别范围，促进免疫识别,这是通过TRL2/TRL4/MyD88通路实现的〔33〕。另一方面外泌体可调控TLR4,在固有免疫中作为运输的载体运输疾病诊断的标志物miRNA。Fang等〔34〕在对弓形虫感染的小鼠实验研究中发现，热休克蛋白70可引起感染小鼠发生致命性过敏反应，而该反应主要依赖TLR4/MyD88通路，热休克蛋白70作为外泌体表面特异性标志物之一，也提示着外泌体在致命性过敏反应中扮演的重要角色。

综上，外泌体目前作为疾病诊断和治疗的研究热点，不仅在过敏性疾病中受到广泛关注，在肿瘤、消化系统疾病、呼吸系统疾病及循环系统疾病中也有不可或缺的作用。生理状态下外泌体承接运输载体的作用，激活信号传输至相应靶点发挥生物效应。病理状态下被大量释放，扩大物质信号传递，促进炎症发生。同时在过敏性疾病中炎症因子及信号通路中通过各种运输传递方式介导各种过敏性疾病的发生发展。鉴于过敏性疾病的复杂性，外泌体的功能及作用还需进一步研究。过敏性疾病治疗主要是对症治疗，外泌体独特的药物运输载体优势不仅可考虑引入过敏性疾病的长期预防或急救治疗，还可考虑运用到临床诊断中，使得临床医生在诊断和治疗过敏性疾病更快捷方便。在法医学领域中由于过敏性猝死案例中常无法得知死者的过敏史、疾病史及生前的治疗史等等使得法医学鉴定者进行死因鉴定困难，外泌体因其良好的双层囊泡可保护外泌体内核酸、脂质及蛋白质，可有效应对尸体自溶和外界环境因素带来的干扰，目前外泌体在过敏性猝死研究尚未开展，未来法医学家可针对过敏性猝死外泌体作为新的研究思路进行探究。