一例新生犊牛病毒性腹泻的诊疗

张力国

（辽宁省农业发展服务中心，辽宁 沈阳 110030）

牛病毒性腹泻，又称粘膜病（Bovine viral diarrhoea/Mucosaldisease），属法定二类动物传染病，是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的传染病。该病在临床上以6～18月龄牛高发，虽发病率不高约5%，但病死率高达90%～100%。我国于1980年首次从国外引进牛的流产胎儿脾脏中分离并鉴定出BVDV，截至目前，我国已有20多个省市自治区报道牛群发生牛病毒性腹泻，因本病具有持续感染，免疫耐受等特点，在牛群中污染率很高，个别牛群高达60%以上，近些年呈逐步上升趋势。该病已成为危害牛群健康的主要传染病之一。

1 发病情况及临床症状

2021年下半年，我省某地牛场新生犊牛陆续开始出现腹泻症状，在断奶前后进行补饲过程中尤其明显，该场共饲养120头，成牛100头、犊牛20头，期间约有1/3犊牛出现腹泻，成牛未见明显症状。患病犊牛初期出现急性腹泻、脱水、精神沉郁、厌食等症状，后期粪便中带有胶冻样分泌物或粪便中带有血丝，期间患病犊牛注射庆大霉素、链霉素、磺胺类药物，症状未见有明显改善，并有犊牛开始陆续死亡。

2 流行病学调查及剖检变化

该饲养场周围无其他规模牛饲养场，有个别散户饲养，但未见相关症状出现，据场主介绍，该场近期陆续从其他地区引进牛，且未经隔离直接混群。对病死牛进行剖检发现，病牛皮下干硬，眼窝深陷，机体消瘦，脱水症状较为明显，心包少量积液，肺脏充血，皱胃黏膜出血，肠道黏膜脱落，黏膜下呈现条索状出血，肠系膜淋巴结出血肿大，直肠及肛门出血。

3 实验室诊断

3.1 血清学诊断随机采集场内20头成牛以及全部犊牛（20头）的血液，共计40份，并离心取血清，使用牛病毒性腹泻病毒抗体检测试剂盒（IDEXX）进行抗体检测。

3.1.1 操作步骤（1）洗涤液制备 将10倍浓缩的洗液置于18～26℃,混旋后确定析出的盐类全部溶解。将浓缩洗液用去离子水作1:10稀释，配置100mL。

（2）取出包被板 并在操作记录表上标记样品的位置，每孔中加100μL样品稀释液。1A、1B各加入25μL阳性对照，1C、1D加入25μL阴性对照，其余各孔对应加入25μL样品。用振荡器振荡反应板，将反应板中的溶液混匀,在18～26℃孵育90min，吸出反应孔中的液体物质并弃入废液缸中。

（3）用300μL左右的洗涤液洗涤每个板孔5次。每个反应孔中加入100μL酶标抗体，在18～26℃孵育30min后，用300μL左右的洗涤液洗涤每个板孔5次。

（4）在每个反应孔中加入100μLTMB底物N.12，在18～26℃孵育10min，在每个反应孔中加入100μL的终止液N.3终止反应。

（5）使用酶标仪在450nm波长测定和记录样品以及对照的吸光值。判断方法：阳性对照OD值≤0.250，且阴性对照OD值-阳性对照OD值≥0.150，实验有效。计算S/P值，S/P＝（样品OD值-阳性对照OD值）/（阴性对照OD值-阳性对照OD值），当S/P≤0.20，判定为阴性；当0.20≤S/P≤0.30，判定为可疑；当S/P≥0.30，判定为阳性。

3.1.2 结果

表1 牛病毒性腹泻病毒抗体检测样品布局

经计算，阴性平均OD值为0.201，阳性平均OD值为0.54，全部样品S/P≥0.30，均为阳性。

3.2 病原学诊断分别采集6头发病犊牛的粪便样品，放入无菌采样管中，使用牛病毒性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒（世纪元亨）进行病原学检测。

3.2.1 操作步骤（1）核酸提取 在操作记录表上标记样品的位置，使用病毒RNA/DNA提取试剂盒（天隆科技-磁珠法），分别吸取无菌采样管各200μL样品，按顺序加入试剂盒配套96孔板的1A～6A列孔内，7A加入200μL阳性对照，8A加入200μL阴性对照，同时各孔分别加入20μL蛋白酶K溶液，放入核酸提取仪，并运行RNA核酸提取程序，进行自动化提取。

（2）实时荧光RT-PCR检测 取27μL无菌无核酸酶水，100μLRT-PCR反应液，4μL酶混合液，19μL荧光探针充分混合后，分装8个反应管中各15μL。

（3）分别取3.2.1.2中提取的样品、阳性对照、阴性对照RNA各5μL，加入相应反应管中，混均并作好相应标记，使用abi7500荧光PCR仪进行以下反应：45℃15min，95℃1min;95℃5s,60℃35s,在每个循环第二步（60℃35s）收集荧光信号，共40个循环。（报告基因“FAM”，淬灭基因“None”）。

表2 牛病毒性腹泻病毒抗体检测样品OD值

3.2.2 结 果

经检测，阳性对照Ct值≤30，阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线，实验结果成立，全部被检样品Ct值≤30，结果判定为BVDV阳性。

3.3 寄生虫镜检采集患病牛及场内新鲜粪便稀释后，压片在显微镜下检查，未观察到球虫及其他寄生虫虫体和虫卵，排除寄生虫感染可能。

4 诊断

根据临床症状并结合实验室检测结果综合判断，确诊该场犊牛腹泻原因是牛病毒性腹泻病毒感染所致。

5 治疗及预防

图1 牛病毒性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测结果

5.1 目前无特效的治疗方法对症治疗和加强饲养管理可以减轻症状，增强机体抵抗力，促使病牛康复。首先要预防因腹泻导致脱水，及时补液，纠正电解质平衡和酸碱平衡，患该病犊牛会因为严重脱水、电解质丢失和酸中毒导致休克和心力衰竭而死亡，补液采用口服或静脉补液，补液量根据犊牛脱水程度而定。其次要预防细菌性继发感染，合理选择抗菌药物，及时使用抗生素。

5.2 怀孕母牛分娩前2～4周接种疫苗可增加初乳中特异性抗体的含量，有利于预防犊牛腹泻。对同群未发病犊牛接种疫苗，疫苗选择上减毒活疫苗存在散毒或毒力返强的风险，还会引起犊牛免疫力下降，因此推荐选择灭活疫苗。

6 防控措施

6.1 加强健康管理保障妊娠母牛特别是妊娠后期母牛的营养，保持母牛乳房卫生健康，母牛产犊过程中的排出物和产后母牛排出的污物要及时处理。犊牛注意保暖，减少因环境改变、运输等因素导致的应激反应。

6.2 加强卫生管理该病的主要传染源就是患病的畜禽，无论是分泌物、排泄物，还是血液、脾脏等，都含有病毒，潜伏期通常7～10d，因此放牧场所和圈舍要定期清扫，粪尿及时清理，每周坚持至少消毒一次，犊牛发病圈舍可使用2%氢氧化钠或5%～10%生石灰消毒。饲喂犊牛的所有工具必须干净卫生，且用后要立即冲刷干净，避免因用具、环境不卫生导致犊牛发生肠道疾病、免疫力下降。

6.3 增强犊牛免疫力确保犊牛及时吃到母乳，犊牛断奶早期少量多次采食优质干草，逐渐增加采食量但不宜过多。日常饲喂要提供充足的蛋白质、VE及亚硒酸钠，饲料或饮水中添加黄芪多糖，提高机体抗病能力。

6.4 牛群净化场内牛群全部检测牛病毒性腹泻病毒，及时淘汰阳性牛，控制传染源。严格把关引进牛，禁止引入病牛或带毒牛，引入检测合格后，隔离观察21d，方可合群。