氨基糖苷类抗生素检测技术的发展

孟 飞，周小华，袁耀佐*

1 江苏省食品药品监督检验研究院，南京 210019;2 南京中医药大学，南京 210023；3 国家药品监督管理局化学药物杂质谱研究重点实验室，南京 210019

20 世纪40 年代氨基糖苷类抗生素被发现，随后几十年逐渐发展并应用于临床，用于治疗各种各样的感染。随着临床应用研究发现各种氨基糖苷类抗生素存在不同程度的耳、肾毒性，导致该类抗生素的临床应用开始减少。随着耐多药病原体的出现，此类抗生素又重新焕发了生机[1]。为保证其临床应用安全、合理、有效，将药物分析与其结合可以有效实现质量控制。早期对于氨基糖苷类抗生素的分析采用微生物鉴定、TLC 法，随着高效液相色谱法的发展，新型检测器开始用于氨基糖苷类抗生素的检测，例如蒸发光散射检测器（ELSD）、脉冲安培检测器（PAD）、电喷雾检测器（CAD）等，由于篇幅原因，本研究不对质谱进行介绍，仅介绍新型水凝聚核粒子计数蒸发光检测器（NQAD）在氨基糖苷类抗生素领域的应用，为其质量检测提供新的思路。

1 氨基糖苷类抗生素概述

氨基糖苷类抗生素（aminoglycoside antibiotics，AGs）是由氨基糖分子与氨基环醇通过醚键连接而成的苷类抗生素，分为天然和半合成两大类。天然来源的包括由链霉菌属培养液中提取获得的链霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、大观霉素等，由小单孢菌属培养液中提取获得的庆大霉素、西索米星、小诺米星等，英文名称后缀一般分别为-mycin和-micin。半合成的氨基糖苷类抗生素是由发酵来源的氨基糖苷类抗生素为前体，通过结构改造而得到，主要有阿米卡星、奈替米星、依替米星、地贝卡星、阿贝卡星等[2，3]。

AGs 是一类临床上治疗细菌感染的重要抗生素，其具有抗菌谱广、杀菌效果强等特点。AGs 的抗菌机制主要通过干扰细菌蛋白质合成而发挥效果，包括抑制70S 始动复合物形成、与30S 亚基蛋白结合，导致氨基酸错配和错误蛋白产生、阻止终止密码子与核蛋白蛋白体结合等多种方式[4，5]。临床上，AGs 对包括需氧革兰阴性杆菌、金黄葡萄球菌、沙门杆菌等多种致病菌导致的感染具有较好的效果，同时抗生素后效应以及与β-内酰胺类抗生素协同作用使得AGs 更具临床价值。尽管氨基糖苷类抗生素有着耳、肾毒性，但对于治疗革兰阴性菌引起的感染有着显著效果，在临床上有很重要的作用[6]。

2 氨基糖苷类抗生素检测技术的发展

AGs 不含共轭结构，多无紫外吸收，且具有极性强、挥发性差等特点，检测相对困难。根据时间及其检测能力、方法的变化可大致分为以下四个阶段[3]：

第一阶段：1970 年以前，微生物检定法，主要用于评价产品的效价，既无组分控制也无有关物质检查。

第二阶段：1970～1990 年，以“半定量法控制杂质限度”为主，例如TLC 法，在柱层析等技术应用前被广泛用于抗生素相关物质的限度控制。

第三阶段：1990～2003 年，衍生化色谱联用检测技术“间接检测”主成分纯度。氨基糖苷类抗生素绝大部分没有紫外吸收或者有很弱的末端紫外吸收，因此衍生化成为此类抗生素早期质量控制常用技术，通过衍生化试剂与待测物发生反应产生有紫外吸收的基团。

第四阶段：2003 年后，HPLC-非衍生化法“直接检测”主成分和/或有关物质。检测技术的发展使得包括HPLC-ELSD 和HPLC-PAD 等非衍生化检测技术被用于AGs 组分和有关物质的控制与评价，并逐渐成为主流选择。随着HPLC 法应用范围的扩大以及检测技术的进步，检测器的种类也越来越多，其灵敏度和重现性越来越好。新型气溶胶检测器如CAD、水凝聚核粒子计数蒸发光检测器（NQAD）的出现，可以弥补ELSD 和PAD 的不足，为氨基糖苷类抗生素的检测提供更多选择性。

目前国内外药典中AGs 质量控制的主要检测手段包括微生物检定、TLC、衍生化HPLC-UV、HPLC-ELSD、HPLC-PAD 等，见表1。

表1 氨基糖苷类抗生素在现行药典中收载情况以及组分及/或有关物质测定一览[3]

2.1 微生物检定法

微生物检定法是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价，该方法被各国药典广泛采用于AGs 的含量测定。

微生物检定法具有设备简单、价格低廉、适于推广使用等优点，而且直观地反映了样品的抗菌能力，符合临床治疗要求。但一方面整个检测存在周期长且程序复杂、干扰因素多等缺点，另一方面微生物检定法选择性差，该方法反映的是药物的总效价，不仅包括抗生素，其杂质和副产物等有可能存在抗菌活性。因此该方法反映不出产品间的质量差别，不能达到监控药品质量的目的。

2.2 薄层色谱法（TLC）

薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定[7]。

该方法设备简单、操作简便快捷、结果直观、兼具分离鉴定双重功能等优点而被广泛应用于药物分析[8]。但存在影响因素多，灵敏度差，定量困难等问题，且薄层板的质量、显色剂用量、外界环境因素对层析行为的影响、操作技巧等均会影响色谱质量，产生结果误差。

2.3 衍生化HPLC-UV/FLD 法

由于氨基糖苷类抗生素结构中缺少生色团/助色团和荧光团，直接采用紫外检测器和荧光检测器通常难以检测，因此需要采用衍生化的方法为氨基糖苷类抗生素引入生色团/助色团和荧光团，以利于检测。衍生化HPLC-UV/FLD 法是利用氨基糖苷类抗生素结构中的活泼基团(如氨基、羰基)与衍生化试剂形成紫外区、使之有吸收或有荧光的官能团，以便于紫外检测或荧光检测[9]。衍生化方法可分为柱前衍生和柱后衍生两种。柱前衍生是将待测物与衍生化试剂进行反应，使待测物具有生色团或荧光团，其优点是反应条件、反应时间以及衍生化试剂不受色谱条件的影响，同时柱前衍生也不需要多余的仪器设备；缺点是操作繁琐，定量不准确。柱后衍生是通过柱后衍生仪器将衍生化试剂与待测分析物在仪器中进行反应然后进行检测，优点是减少人为误差、操作简便，可以实现自动化控制；缺点是需要额外的仪器设备，同时对于衍生化试剂也有限制[9-11]。在早期美国药典、英国药典、欧洲药典、中国药典中，衍生化方法一直有着重要作用。例如早期各国药典通过衍生化方法对硫酸庆大霉素质量进行控制。2020 版《中国药典》[7]采用衍生化方法对阿米卡星进行质量控制。由于硫酸依替米星没有紫外吸收，张玫等[9]采用柱前衍生测定其含量，赵敬丹等[12]采用HPLC-FLD 法建立了硫酸卡那霉素注射液有关物质的质量控制方法。但是由于衍生化法操作复杂耗时；各种实验因素须进行优化研究;衍生条件难以控制，重复性低；衍生化反应复杂，一种样品可能产生多种衍生产物，且衍生试剂也会干扰检测，从而无法明确判断检测到的杂质的来源[13]。

2.4 HPLC-ELSD 法

ELSD 通常由3 部分组成，即雾化器、漂移管和光散色池。此类检测器属于质量通用性检测器，待测物质不需要具备生色团或萤光团，它是根据待测物通过光散色池，激光照射待测物，则待测物对光进行散射，通过检测器将光信号转化为电信号。其检测过程分为3 个步骤：雾化、蒸发、检测。雾化阶段：将色谱柱洗脱出来的液体通过氮气进行喷雾形成小液滴；蒸发阶段：流动相包裹待测物形成的小液滴通过漂移管，挥发性的流动先被蒸发形成待测物小颗粒；检测阶段：待测物小颗粒通过激光对光进行散射，检测器将光信号转化为电信号，从而记录色谱图。蒸发光散射检测器的优点是待测物不需要具有生色团或荧光团，缺点是其根据光的散射对待测物进行检测，不同的物质具有不同的光散射强度，同时由于颗粒大小程度的不同，对光的散射程度也不一样，这就导致不同物质响应不一样。另外，对待测物和流动相也有特殊要求，比如待测物需要具有不挥发性或半挥发性的性质，流动相要具有挥发性，这大大限制了流动相的选择，如果一些杂质分离度达不到要求，可能需要添加一些离子对试剂，离子对试剂的选择也要具有挥发性，导致选择范围变窄，又比如调节流动相的pH，也要求酸或碱具有挥发性，同时酸碱的加入也会引起基线噪音变大；另外待测物峰面积与浓度不成线性关系，而是对数关系，使计算繁琐[14-16]。2020 版《中国药典》中大部分氨基糖苷类抗生素的质量控制采用HPLCELSD 法。姚永青等[17]采用HPLC-ELSD 法对硫酸庆大霉素颗粒中的C 组分进行研究；赵卫等[18]采用HPLC-ELSD 法建立了硫酸依替米星氯化钠注射液有关物质的质量控制方法；巩丽萍等[19]采用HPLCELSD 法建立了注射用盐酸大观霉素含量和有关物质的质量控制方法；赵敬丹等[12]采用HPLC-ELSD法建立了硫酸卡那霉素注射液有关物质质量控制方法；Wang J 等[20]采用HPLC-ELSD 法建立了硫酸蛭菌素有关物质的质量控制方法，将蛭菌素与相关杂质分离度良好，同时通过HPLC-MS 对相关杂质进行了表征；王金凤等[21]采用HPLC-ELSD 法建立了硫酸卡那霉素注射液含量测定方法。此方法在《中国药典》中发挥了巨大作用，随着应用的深入，一些问题逐渐暴露出来，例如重复性及重现性不佳，其原因有仪器自身原因，如漂移管长时间使用易产生污染，光源长时间使用不稳定，气体流速不稳定等；其次还有操作人员所致的人为误差[3]。

2.5 HPLC-PAD 法

高效液相色谱-电化学法是根据电化学原理和物质的电化学性质进行的，用于检测在液相色谱中具有电活性的物质，电化学检测器有安培、极谱、库仑和电导检测器4 种，PAD 应用较为广泛，它是利用外加电压，使待测物在电极表面发生氧化还原反应，从而产生电流[22]。PAD 检测器灵敏度高，专一性强，可用于没有紫外吸收或不能发出荧光、但具有电活性的物质的检测，例如糖醛、氨基糖和氨基酸等。同时操作简单，对流动相的挥发性没有要求，成为继HPLC-UV 及HPLC-ELSD 后应用前景广泛的检测器之一，许多国家也越来越关注电化学检测器法。2020 版《中国药典》采用HPLC-PAD 法对依替米星进行质量控制，BP 2021 版有5 类氨基糖苷类抗生素采用HPLC-PAD 法进行质量控制，USP43-NF38 有3 类氨基糖苷类抗生素采用HPLC-PAD 进行质量控制。王琰等[24]使用四电位HPLC-PAD 法测定盐酸大观霉素及有关物质；熊雯等[25]采用HPLCPAD 法测定硫酸庆大霉素氯化钠注射液中庆大霉素C 组分及有关物质；朱晓玥等[26]采用HPLC-PAD法测定硫酸依替米星氯化钠注射液中有关物质。电化学检测器的优点是只要流动相不具有电化学活性即可，比ELSD 的流动相选择范围更加大，PAD对于流动相要求低，可根据需要添加酸碱盐、离子对试剂、调节pH 值[23]；在检测方面，相对于ELSD 有更高的灵敏度，更宽的线性范围。电化学检测器的缺点是重现性差，电极易污染氧化，例如早期各国药典标准采用三电位波形，这就导致电极易老化，当沉积的分析物的反应产物留在电极表面，采用相对较高电位来清理电极，这就导致金氧化物的形成，抑制进一步的反应，导致检测器的灵敏度和精度随着时间的推移变得较差[27]。为了克服这些缺点，Ding Y 等[28]采用脉冲安培检测新霉素，并对四电位波形进行优化。目前大多数脉冲安培采用四电位波形，这将减少金的损失，从而防止金电极的缓慢衰退，并提高了长期稳定性和灵敏度。我国研究人员近年来尝试利用四电位的HPLC-PAD 对各类抗生素进行检测，建立符合我国药典的检测方法，并取得了长足的进步。

2.6 HPLC-CAD 法

CAD 属于气溶胶检测器的一类，检测过程主要分为4 个部分：喷雾、蒸发、荷电、检测。它的原理不同于其他类型的气溶胶检测器，主要是利用氮气离子碰撞待测物质，使其带电并被监测到。具体检测原理如下：待检测组分经过色谱柱洗脱后进入电喷雾检测器，在雾化室通过氮气喷雾形成小液滴，一些较大的液滴由于重力原因沉降经废液管流出，剩余的小液滴由流动相包裹，通过干燥管时挥发性的流动相会被蒸发掉，这时待测组分形成干燥的小颗粒并进入采集器，采集器中的静电检测装置采集所有的电荷，将其转化为电信号，从而可以看出所带电荷越多，电信号越强，同时带点颗粒表面积越大，其所带电荷越多，响应值就越高[29，30]。目前国内外药典还没有收载HPLC-CAD 用于氨基糖苷类抗生素的质量控制方法（见表1）。Long Z 等[31]采用HILIC和电喷雾检测器建立了阿普霉素及其杂质的分析方法；Joseph A 等[32]建立了HPLC-CAD 法测定药膏中硫酸庆大霉素及其有关物质的方法；Stypulkowska K 等[33]采用高效液相色谱-质谱联用电喷雾检测器测定了新霉素及其相关物质；Stypulkowska K 等[34]利用HPLC-CAD 法同时测定了林可霉素、大观霉素及其杂质；Holzgrabe U 等[35]利用HPLC-CAD 并结合TOF-MS 对硫酸链霉素中的杂质进行鉴别。CAD 具有灵敏度高，重现性良好的优点，待测组分具有不挥发或者半挥发性质即可，流动相以及离子对试剂需要具有挥发性。但是CAD 也有其局限性，不能用于挥发性待测组分的检测，同时待测组分的峰面积与浓度不成线性关系、信号与浓度动态范围较窄。

2.7 HPLC-NQAD 法

NQAD 全称为水凝聚核粒子计数蒸发光检测器，其属于气溶胶检测器的一类。其核心元件为水凝聚核粒子计数器，检测过程分为喷雾、汽化、凝结、检测4 个过程，前两个过程与ELSD 和CAD 有相似之处。第三个阶段是NQAD 的核心阶段，待测组分经色谱柱洗脱流出雾化形成小液滴，通过汽化变成干燥的小颗粒，这个阶段通过水蒸气将干燥小颗粒包裹长大到微米级别，通过激光脉冲计数器对待测物进行定量。QAD 是一款质量性检测器，它的响性与待测组分的浓度呈正相关，与待测组分化学性质无关，有较好的灵敏度，待测组分的峰面积与浓度成线性关系，这使得NQAD 计数更加简便，同时NQAD 操作简单，保养维护方便，灵敏度降低只需要更换“wick”即可。NQAD 属于气溶胶检测器，待测组分需要具有不挥发或者半挥发性，流动相要具有挥发性。目前NQAD 也已应用在氨基糖苷类抗生素的检测中。许明哲[11]利用NQAD 进行了硫酸庆大霉素C 组分的测定，其分离效果良好；王金凤等[21]比较了HPLC-ELSD 法和HPLC-NQAD 法测定注射用硫酸卡那霉素含量，通过比较两款检测器，发现ELSD 的线性范围比NQAD 更宽，NQAD 在较低浓度范围形成良好的线性关系，灵敏度比ELSD 更高。

3 小结

AGs 为临床上最为常用的抗感染药物之一，此类药物大多数无紫外吸收,抗生素微生物检定法、高效液相色谱衍生化法及ELSD、PAD 是当前各国药典和文献报道中测定该类药物含量和/或有关物质的主要方法。检测器作为HPLC 法的重要部分，其中最常用的检测器有紫外检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电喷雾检测器、荧光检测器、电化学检测器、安培检测器、水凝聚核粒子计数检测器等，检测器的发展程度直接影响着HPLC 的技术进步与发展速度。一般来说，选择性和灵敏度是检测器最重要的两个要素。紫外检测器只能检测在紫外区有吸收的物质，而且实验所用流动相在相应区域无紫外吸收[36，37]。荧光检测器只适用于能够产生荧光的物质，对溶剂的纯度、pH 值、样品浓度、检测温度等有很高的选择性[38]。流动相中溶解的氧气及温度对电化学检测器检测干扰较大。蒸发光散射检测器不能用非挥发的缓冲盐及表面活性剂，流动相中有机成分高时信号则可能被假性放大十几倍，影响定量分析[15，16]。示差折光检测器一般不能用于梯度洗脱[39]。电喷雾检测器的响应会受流动相组成的影响，特别在梯度洗脱时，流动相中有机相比例上升、响应增大会影响分析[40，41]。但水凝聚核粒子计数检测器弥补这一不足，最大限度兼顾检测器的适用性和选择性，它是通用型、高灵敏度检测器，适用于几乎所有物质（挥发性物质除外）的检测，线性范围宽且信号响应具有质量一致性，这种独特的性质可开拓液相色谱的新领域。