叶用莴苣种质资源表型性状及营养品质综合评价

田雪珂， 钟启文， 孙雪梅， 张广楠， 杨世鹏， 谭 龙， 王丽慧

(青海大学农林科学院，青海省蔬菜遗传与生理重点实验室，青海西宁810016)

叶用莴苣(LactvcasativaL.)，又被称为生菜，属菊科莴苣属，一年生或两年生草本作物[1]，具有生育期短、产量高的特点，在设施栽培中应用广泛[2]。叶用莴苣喜冷凉[3]，可分为皱叶生菜、散叶生菜、结球生菜三类[4]。叶用莴苣含有丰富的类胡萝卜素、维生素C、可溶性碳水化合物等营养物质[5]，具有降血压、预防心律失常[6]等保健功能。维生素C通常被转化成2种形式：一是抗坏血酸(AA)，具有抗氧化特性；二是氧化产物脱氢抗坏血酸(DHAA)[7]，用于维持人体正常生长发育。维生素C人体不能自身合成，必须通过食物获取，且容易被高温破坏，而叶用莴苣营养丰富，可做凉菜食用[8]，作为补充维生素C的蔬菜具有较大优势。

种质资源是研究作物遗传生长的基础[9]，也是影响现有遗传资源质量和数量、创新改良深度以及支持当今农业发展的关键因素[10]。种质资源鉴定是科学研究的主要任务之一。通过资源的鉴定，评价遗传资源在生产和科研方面的应用潜力[11]。种质资源表型评价比分子评价更为直接，已被广泛应用于核心种质的构建和分类[12]。如Lebeda等利用该方法对野生莴苣进行农艺性状的调查[13]。董洁等[14]利用表型评价对55份叶用莴苣进行研究，其变异系数分布范围为8.82%～98.85%。目前随着中国对生菜多样性需求的增加，资源的引进和种质资源的丰富显得极其重要。种质资源引进是丰富遗传资源多样性的重要手段[15-17]。据不完全统计，截至2021年中国已收集莴苣资源4 000份[18]，并开展了农艺性状调查、抗病试验、品质分析，通过试验验证培育出了一些优良品种。采用主成分分析、聚类分析、多样性指数等统计分析方法对种质资源质量进行综合评价，可使质量评价更加科学可靠。近年来，将主成分分析和聚类分析相结合的综合评价分析方法应用于葡萄[19]、杨梅[20]、苹果[21]、猕猴桃[22]和枸杞子[23]等果实品质评价的研究已成为热点。

本研究以青海省农林科学院收集的13份叶用莴苣种质资源为材料，于2021年在青海省西宁市园艺创新基地进行栽培及鉴定，对叶形和叶色等质量性状以及叶柄厚等数量性状进行评价，结合聚类分析和主成分分析进行综合评价并筛选优良种质。

1 材料方法

1.1 试验材料

供试材料为青海大学农林科学院园艺创新基地收集到的叶用莴苣种质资源，共计13份。

1.2 试验方法

调查并记录叶用莴苣的株高、叶长、叶宽、叶柄长、叶柄厚、叶柄宽、叶数。对质量性状进行赋值并将数据进行标准化，赋值标准参考李锡香等[24]的《莴苣种质资源描述规范和数据标准》(表1) 。

表1 叶用莴苣种质资源10个描述型性状及分级标准

试验材料于2020年种植于青海省农林科学院园艺创新基地，从每份材料中选择3株生物学重复对其农艺性状进行调查，并选取3个独立的生物学样本用于后续营养指标的测定。栽培基质为珍珠岩∶蛭石=1∶1(质量比)，混合均匀。

1.3 数据统计分析

使用Excel2019对测试数据进行整理，利用SPSS21.0对数据进行统计分析、聚类分析、主成分分析。并对13份叶用莴苣种质资源的10个农艺性状及6个营养指标的平均值(μ)、范围(R)、标准差(s)、变异系数(CV)和多样性指数(H′)，使用Duncan’s多重比较法分析差异的显著性。根据各性状数据的平均值和标准差对多样性指数进行分级，分为9个级别：第1级为[Xi<(μ-2.0s)]，[Xi<(μ-1.5s)]为第2级，每级增加0.5s，至第9级为[Xi>(μ+2.0s)]。因此，根据相对频率(Pi)计算多样性指数H′。采用香农多样性指数(H′)，计算公式如下[25]：

隶属函数计算公式如下[26]：

Xi为所调查各指标的测定值，Xmax、Xmin为样品某一指标的最大值、最小值。

1.4 营养品质性状测定

1.4.1 可溶性蛋白质含量测定 参考王学奎等方法[27]进行测定。

1.4.2 有机酸含量测定 有机酸提取方法：预冷研钵，称取2 g叶片，加入2.5 ml KH2PO4缓冲液，研磨均匀，再用2.5 ml KH2PO4缓冲液冲洗研钵，移至10 ml离心管中，定容，12 000 r/min离心10 min，取1 ml上清液，过0.22 μm滤膜，放入样品瓶中采用二元梯度液相色谱仪进行测定。流动相A为缓冲液KH2PO4，流动相B为甲醇(色谱纯)，流速0.5 ml/min，柱温35 ℃，检测波长210 nm、214 nm，进样量20 μl。

1.4.3 可溶性碳水化合物含量测定 可溶性碳水化合物的提取方法：称取肉质茎粉末0.84 g于试管中，加20 ml超纯水，摇匀，沸水浴30 min，晾至室温，将上清液倒入10 ml离心管中，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液，用蒸馏水定容至25 ml。取上清液1 ml，过0.22 μm过滤器，用高效液相色谱仪测定可溶性碳水化合物含量。流动相为超纯水，进样量5 μl，柱温80 ℃，流速1 ml/min。

1.5 试验仪器

可溶性碳水化合物含量测定仪器：日本岛津高效液相色谱仪(RID-20A)，色谱柱Shodex SUGAR SC1011，预柱Shodex SUGAR SC- G6B，检测器为示差检测器。有机酸含量测定仪器：日本岛津高效液相色谱仪(SPD-20A)，色谱柱Shodex SUGAR SC18，预柱Shim-pack GIST，检测器为紫外检测器。分光光度计：Specord210plus型可见光分光光度计(德国耶拿分析仪器股份公司产品)，离心机：AG 22331 Hamburg 型离心机(Eppendorf公司产品)。

2 结果与分析

2.1 叶用莴苣种质资源农艺性状及营养品质的遗传多样性分析

由表2可知，13份叶用莴苣种质资源的16个性状均呈现不同程度的多样性，各指标的变异系数范围为17.94%～91.86%，其中苹果酸含量的变异系数最高(91.86%)，变幅为882.13～9 528.48 μg/g，其余指标的变异系数依次排列为葡萄糖含量(59.61%)>蔗糖含量(56.24%)>抗坏血酸含量(55.38%)>叶柄长(48.2%)>果糖含量(44.48%)>叶片数(38.41%)>叶柄厚(32.54%)>叶柄宽(27.51%)>叶宽(27.06%)>单株质量(24.53%)>干质量(24.06%)>株高(23.89%)>叶长(23.52%)> 鲜质量(20.80%)，可溶性蛋白质含量的变异系数最小，为17.94%，变化范围为2.72～5.19 mg/g。其中叶柄长、叶柄厚、叶片数、蔗糖含量、葡萄糖含量、果糖含量、抗坏血酸含量和苹果酸含量变异系数均≥30%，具有较大的改良潜力。多样性指数的变化范围为1.38～1.99，以叶长为最大，其余依次是单株质量>葡萄糖含量>抗坏血酸含量>叶宽>叶柄长=果糖含量>可溶性蛋白含量>株高=叶柄宽=叶柄厚=鲜质量>干质量>蔗糖含量>苹果酸含量，叶片数的多样性指数最小，为1.38，所有性状的的多样性指数均大于1.3。

表2 叶用莴苣种质资源表型及品质性状的变异情况

2.2 叶用莴苣主要农艺性状的鉴定评价

叶片是叶用莴苣的主要食用部位[4]。13份叶用莴苣种质资源中，结球莴苣1份，散叶莴苣12份。其中紫叶莴苣有6份，绿叶莴苣7份。各性状调查结果见表3。由表3可以看出，叶用莴苣的农艺性状表现出多种类型，其中结球莴苣为绿叶莴苣(那罗)，且结球性较松。叶片形状以提琴形为主，匙形次之。叶尖分为圆形、钝尖、尖。叶缘以钝齿状为主。叶裂以无裂为主。叶面均有光泽。叶片颜色以浅绿色和紫红色为主。

表3 13 份叶用莴苣种质资源形态学特征

2.3 叶用莴苣资源基本性状的相关性

叶片是叶用莴苣加工利用的主要部分，在叶用莴苣栽培过程中，选择叶片较长、较宽且单株质量较大的资源具有重要意义。由表4可知，样品干质量与叶柄宽相关性最大，为0.890；叶宽与可溶性蛋白质含量呈正相关关系，与叶片数呈负相关关系。叶长与叶柄长、果糖含量正相关，叶柄宽与叶柄厚正相关，样品鲜质量、干质量均与单株质量极显著正相关。在实际生产中，株高可以用叶长来衡量，而利用叶柄长短可以衡量叶片的长度，从而预测叶用莴苣的产量和品质。

表4 叶用莴苣16个基本性状的相关性

描述型性状及分级标准见表1。

2.4 叶用莴苣资源来源及隶属函数分析

由表5可知，13份叶用莴苣资源的隶属函数均值介于0.427～0.532，隶属函数均值为0.493。大于均值的资源名称分别是京研罗马、超级意大利、红象、红莎、绿雅、普希金、罗生1号、绿莎及贝尔紫。其中罗生1号均值最高(0.532)，原因是该材料在表型性状上极具优势，尤其是集中在叶宽、鲜质量及单株质量方面。

表5 13份叶用莴苣资源10个性状隶属函数均值

2.5 叶用莴苣种质资源聚类分析

利用SPSS16.0对13份叶用莴苣资源农艺性状进行聚类分析(图1)，在欧氏距离为4处将13份叶用莴苣资源聚为5大类。其中，类群1中包括5份资源，该类资源的叶长分布在13.07～19.53 cm，干质量分布在2.87～3.38 g，单株质量分布在54.27～57.91 g。类群2包括1份资源。类群3包括3份资源，该类资源的株高主要分布在23.03～26.83 cm，叶柄厚主要集中在2.29～2.45 mm。类群4包括3份资源，该类资源的叶宽分布在10.93～11.40 cm，鲜质量主要分布在75.38～76.36 g。类群5包括1份资源。

图1 13份叶用莴苣资源基于10个性状的聚类结果

2.6 叶用莴苣种质资源主成分分析

以特征值大于1、方差贡献率在80%以上为标准，对叶用莴苣16个指标进行主成分分析，得到累计方差贡献率为95.44%，可以解释近90%的遗传信息。

质量指标聚类分析可以从多个维度分析评价指标[28-29]。由表6可知，第1主成分因子能够反映原始数据中41.804%的信息，其中与株高、叶长和叶宽相关的指数因子载荷值高于0.817。第2主成分因子的方差贡献率为21.157%，主要由样品的鲜质量和干质量决定，负荷值分别为0.811和0.691。叶用莴苣的产量取决于植株高度、叶片长度、叶片宽度和鲜质量[30]，增加其中一个可以提高产量，因此第1和第2主要成分可以定义为产量影响因子。第3主成分因子的方差贡献率为18.093%，决定其大小的分别为单株质量、可溶性蛋白质含量和抗坏血酸含量，特征值分别为0.419、0.663和0.701。决定第4主成分大小的因子主要为叶柄厚及叶片数，特征值分别为0.474和0.650。第5主成分因子的方差贡献率为6.798%，各指标之间相差不大，仅抗坏血酸、果糖含量等表现较为突出，因此可将第3、4、5主成分命名为营养成分影响因子。前5个主成分共筛选出株高、鲜质量、单株质量、可溶性蛋白质含量、叶柄厚、抗坏血酸含量、果糖含量7个代表性指标，作为叶用莴苣种质资源评选和选育工作的重要指标。

表6 叶用莴苣种质资源主成分特征值

以X1～X16分别代表标准化的16个指标数据数值代入到2个主成分中，获得5个主成分因子得分公式[31-32]如下：F1=0.096X1+0.094X2+0.849X3+0.367X4+0.744X5+0.784X6-0.517X7+0.303X8+0.637X9+0.681X10+0.641X11+0.156X12+0.601X13+0.871X14+0.333X15+0.507X16，F2=-0.199X1-0.224X2+0.048X3-0.870X4+0.556X5+0.152X6-0.482X7+0.811X8+0.691X9+0.431X10+0.075X11+0.105X12-0.095X13-0.217X14-0.160X15-0.743X16，F3=-0.229X1-0.338X2+0.272X3+0.238X4-0.184X5+0.077X6-0.041X7+0.328X8-0.146X9+0.419X10+0.663X11-0.941X12-0.452X13-0.44X14+0.701X15+0.189X16，F4=-0.236X1-0.008X2-0.387X3+0.096X4+0.044X5+0.474X6+0.650X7-0.087X8+0.044X9-0.014X10-0.159X11-0.167X12+0.322X13+0.216X14+0.306X15+0.208X16，F5=0.164X1+0.057X2-0.115X3-0.132X4+0.267X5-0.180X6+0.110X7-0.303X8+0.290X9-0.340X10+0.135X11+0.147X12-0.553X13+0.174X14+0.493X15+0.009X16。各指标综合得分公式为F=0.418F1+0.212F2+0.181F3+0.076F4+0.068F5，按照计算公式得到叶用莴苣种质资源综合得分。综合得分越大，种质资源越好。由表7可知，综合得分排名较高的4个品种依次为普希金(3.65)>超级意大利(3.47)>绿雅(2.75)>京研意大利(1.98)，在种质资源应用中可优先考虑这些品种。

表7 叶用莴苣性状综合评价表

2.7 叶用莴苣农艺性状显著性差异分析

由表8可知，各品种之间农艺性状存在显著差异。贝尔紫的株高最高，为27.27 cm，株高最小的品种为那罗(13.83 cm)。叶长最大的品种为京研罗马(25.33 cm)，最短的品种为凤蝶(11.27 cm)。叶宽值最大的品种为红莎，最小的品种为凤蝶(仅为5.17 cm)。叶柄最长的品种为绿雅，京研罗马次之；叶柄最宽的为普希金，最窄的为凤蝶；叶柄厚最厚的为超级意大利，最薄的为红莎(0.91 mm)；叶片数最多的品种为凤蝶，最少的品种为红莎和绿雅。样品鲜质量和干质量最大的品种为超级意大利和普希金，最低的品种均为凤蝶。单株质量最大的为超级意大利，京研罗马次之。综上所述，京研罗马的农艺性状表现较好，在品种选育时可重点关注该品种。

表8 13份叶用莴苣资源农艺性状差异显著性分析

2.8 叶用莴苣营养成分差异显著性分析

由图2可知，绿莎的抗坏血酸含量最高，为290.35 μg/g，含量最低的为罗生1号(29.53 μg/g)。苹果酸的含量最高的品种为京研罗马(9 528.48 μg/g)，最低的品种为普希金(882.13 μg/g)。贝尔紫中可溶性蛋白质含量最高，为5.19 mg/g，含量最低的品种为雅丹，仅为2.72 mg/g，极差为2.47 mg/g。叶片中果糖含量最高的品种为绿雅，达到215.43 mg/g，超级意大利次之，果糖含量为181.08 mg/g，凤蝶的果糖含量最低，仅为43.91 mg/g。葡萄糖含量最高的品种为超级意大利，为226.51 mg/g。蔗糖含量最高的品种为贝尔紫，为221.46 mg/g，红莎的蔗糖含量最低，为27.62 mg/g。综上所述，贝尔紫的可溶性蛋白质含量及蔗糖含量较高，在生产中可根据需求培育高品质的品种。

A:绿雅；B：超级意大利；C：罗生1号；D：贝尔紫；E：红象；F：绿莎；G：京研罗马；H：雅丹；I：那罗；J：红莎；K：凤蝶；L：普希金；M：京研意大利。同一指标中不同小写字母代表0.05水平差异显著。

3 讨论

3.1 叶用莴苣资源表型性状及营养品质的多样性

植物的表型性状具有较为直观、便于调查等特点，是评价种质资源多样性的重要指标。表型性状受遗传因素与环境因素的共同影响。株型中的重要表型性状是株高和茎粗，能够反映植株的活力及生长状况[33]。本研究对13份叶用莴苣的10个农艺性状及6个营养成分进行多样性指数计算、主成分分析、生理指标的测定，结果表明这些种质资源的遗传背景较为丰富，这与小麦[34]、高粱[35-36]、黄瓜[37]等其他作物的研究结果相似。变异系数通常用来反映性状之间的离散程度以及在种质资源之间的变异程度[38-39]。本研究中测得的指标数据的变异系数均大于10%，变异系数最大的是苹果酸含量，为85%，变化范围为882.13～9 528.48 μg/g，可溶性蛋白质含量的变异系数最小(17.94%)，变化范围为2.72～5.19 mg/g，表明所收集到的资源遗传多样性较为丰富。

3.2 叶用莴苣种质资源表型性状及营养品质的综合评价

基于主成分分析进行种质资源表型性状评价已广泛应用于西瓜[40]、番茄[41]、桃子[42]、柑橘[43]等作物。本研究中将16个性状分为5个主成分，累计贡献率达到95.44%，将1、2、3主成分归为产量影响因子，4、5主成分归为营养成分影响因子， 各主成分所包含的性状可以作为叶用莴苣种质资源创新的参考。

聚类分析可根据性状的相似程度对资源进行分类，用于反映亲缘关系的远近[44-46]。基于表型性状对物种进行聚类分析已被广泛应用于蔬菜研究中。如王业社等[47]利用聚类分析方法将紫薇品种划分为5大类群，将具有相对一致特征的品种划分为一个类群，组群间具有较大的差异。本研究把13份叶用莴苣材料分为5个群，类群1中包括6份资源，该类资源的叶长分布在13.07～19.53 cm，干质量分布2.87～3.38，单株质量分布在54.27～57.91 g。类群2包括1份资源。类群3包括3份资源，该类资源的株高主要分布在23.03～26.83 cm，叶柄厚主要集中在2.29～2.45 mm。类群4包括3份资源，该类资源的叶宽分布在10.93～11.40 cm，鲜质量主要分布在75.38～76.36 g。类群5包括1份资源。开展种质资源评价是种质资源筛选的主要环节，根据筛选结果可以选出大量优异种质资源。本研究根据综合得分对13份叶用莴苣种质资源进行评价，综合得分排名较高的4个品种依次为普希金(3.65)>超级意大利(3.47)>绿雅(2.75)>京研意大利(1.98)，在后续品种选育过程中可根据品种抗逆性及产量稳定性等持续观测。