牛传染性鼻气管炎诊断方法概述

孙兴忠，董 航，王 楠，邵洪泽，宫鹏涛，苑淑贤，姚新华，曹利利*

1.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春 130062；2. 吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062

牛传染性鼻气管炎（IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）感染所导致的呼吸道疾病，发病症状以鼻炎、窦炎、身体高热、呼吸困难、流鼻涕等炎性症状，IBRV又被人们称为牛疱疹病毒1型（BHV-1）。在一般情况下，病毒进入牛体后，经常潜伏在三叉神经以及腰荐部神经，可造成牛只潜伏性且持续感染，严重病例可使终身带毒。不同大小的牛只都可感染该病，可通过呼吸道或者生殖途径传播病毒，与此同时，当隐性感染后的牛免疫力低下或受到异常刺激后，体内的病毒被激活而排出病毒，从而感染其它牛只，所以想根治该病较为困难。

最近几年，我国IBR的发病率在逐年增加，而该病对大型养殖场的影响较大，对养牛业造成一定经济损失，影响养牛业的发展。而IBRV的感染大多隐性时间较长，所以对于该病防控较为困难，现阶段探索快速有效的诊断方法，对该病的防控至关重要。本文论述IBRV国内外常用的诊断方法，为今后检测和防控提供一定依据。

1 病原学诊断

1.1 病毒分离鉴定

通常情况下，根据病牛患病后表现出的不同症状而采集不同部位的样品，如呼吸道型要采眼分泌物以及鼻液；生殖道类采集阴道的分泌物和外阴部的黏膜；脑膜炎采脑组织；流产型采胎儿心、肝、肺、肾等实质性器官等。IBRV的培养一般常用牛肾细胞（MDBK）来培养效果最佳，细胞感染后发生病变在4 d左右，细胞出现皱缩、变圆和似葡萄形状聚集并出现空洞等形态即为病变细胞[1]。形态上观察为初步确诊为IBRV，想深一层确诊是否感染IBRV需进行中和试验、间接免疫荧光试验以及单抗试验[2]。王延涛[3]从患病牛场的牛阴道分泌物中得到病毒，并将该IBRV用于进出口检疫中对病毒的快速检测。李琳琳[4]等运用MDBK从患病进口奶牛鼻炎中获得IBRV，获得的病毒在MDBK上培养出现细胞病变（CPE）,并用PCR验证出现明显目的条带。该方法鉴定准确，但需耗费时间，临床上使用较少。

1.2 病毒核酸检测

1.2.1 常规PCR检测方法

现阶段，PCR方法用于IBRV病毒检测比较普遍，主要因其具有快速、高特异性和高敏感性等特点，能够检测牛血清、鼻拭子、呼吸道组织等样品中微量IBRV存在。徐娜等[5]利用IBRV的gE和gB核酸序列，设计引物，最终建立PCR方法；林海等[6]利用IBRV TK设计引物，运用PCR方法鉴别野毒株以及TK基因缺失株；王嵩等[7]利用保守序列gB设计引物，通过优化条件，建立快速PCR检测方法。该方法优于病毒分离法和血清学方法，但也会有假阳性、假阴性结果干扰，具有一定缺陷。

1.2.2 荧光定量PCR检测方法

荧光定量PCR方法，是近几年发展起来的方法，该方法要比常规PCR方法拥有更加高的敏感性、特异性，可以通过结果直接确定感染牛只是否感染IBRV病毒，所以该方法已广泛运用于实际检测。唐泰山等[8]利用gE和gB基因序列，设计2对引物和探针，并把病毒10倍稀释后检测同时对三种病毒特异性检测，结果灵敏度达到0.02 T CID50,且特异性好无交叉反应。乔波等[9]gB基因保守区设计引物和探针，建立荧光定量PCR方法，可对疑似病例快速检测。谢志勤等[10]分别运用IBRV gB基因保守区设计引物和探针、BVDV基因设计特异引物和探针，建立临床鉴别的双重荧光PCR方法。

2 血清学检测

2.1 中和试验（VN）

中和试验是IBR检测最经典和标准的方法，同时是OIE要求对该病检测的方法。该方法原理是用已有的BVDV病毒检测待检血清的中和抗体，而后检测病毒的感染力以及免疫血清中和后的感染力。该方法优点特异性、敏感性较高，但操作时间长、繁琐而且极易受各种因素影响，因此目前用该方法比较少，将被酶联免疫吸附试验（ELISA)所取代。

2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA)

ELISA原理是将酶与抗原（抗体）结合形成酶标物，特异性吸附在固相载体上，而酶标记的抗原（抗体）仍保存酶活性和免疫活性。该种检测方法具有快速、操作简单、特异性高等优点，可以用来检测牛血清、血浆、奶样中是否有病毒感染，并且能够区分免疫和自然感染病毒。朱远茂等[11]建立间接ELISA方法检测牛血清抗体，具有较好特异性和重复性，与国外试剂盒符合率达96.3%。李兆利等[12]运用gB蛋白基因建立间接ELISA方法，该方法具有简便、易推广、检测样本量大等诸多优点，较多应用于流调和临床诊断中。马辉等[13]通过原核表达gC蛋白，建立双抗夹心ELISA方法和单克隆抗体，有较好特异性和敏感性，作为IBR的一种快速诊断方法。周跃辉[14]通过原核表达gD蛋白，建立双抗夹心ELISA方法和单克隆抗体，有较好特异性和敏感性,可作为流调和诊断IBR的方法。

2.3 琼脂扩散试验

琼脂扩散试验是运用病毒抗原检测血清中抗体，也可用IBR阳性血清检测培养细胞或采集的病料，Suresh S在1993年，成功运用对流免疫扩散和免疫扩散方法检测IBRV。该方法操作比较简单，但实际检测中敏感性较低，检出率低。

2.4 间接血凝试验（IHA）

IHA是一种简单的检测血清中抗体方法，一般分微量凝集和试管凝集两种方法，结果判定以红细胞凝集程度表示阳性反应强弱。陈天祥等[15]分别创建IHA方法，临床运用较好。该方法简单、快捷，但特异性差易出现假阳性。

3 结语

近年来，我国规模化养牛业的快速发展，牛只的跨省转运以及国外引进良种等原因，致使IBR的发生也在逐年呈上升趋势，因该病现阶段没有特效药物治疗，这给养牛业带来巨大经济损失。现阶段，IBR拥有多种诊断该病的方法，但每一种诊断方法都有各自的特点以及缺点，在使用过程中要汲取各自的优缺点选择合适的方法进行诊断。国内已研究并上市IBR疫苗，这也为今后IBR疫苗研发奠定基础，同时这也对IBR病诊断技术体现出更高的要求和重要性。随着新仪器和新技术的不断发展，IBR的诊断技术不断向着高效、敏感、简便、快速、特异等目标发展，配合现有疫苗使用，在控制或根除IBR上起到重要作用，使养牛业不断进步发展。