慢性牙周炎通过PERK-CHOP信号通路介导睾周脂肪细胞凋亡的研究

陈伊燕，伍倩琪，陆佳艺，郭吕华

牙周炎是严重危害口腔健康的慢性炎症性疾病，不仅破坏口腔局部软硬组织，还对全身健康造成不良影响[1]。研究表明，牙周炎的持续感染可加重肥胖、糖尿病等全身性疾病[2-3]，与内脏脂肪组织的功能受损有关[4-5]。本课题组前期研究发现，牙龈卟啉单胞菌来源的脂多糖(Porphyromonasgingivalis-lipopolysaccharid，P.gingivalis-LPS)可通过内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)促进内脏脂肪细胞的胰岛素抵抗[6]。蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)是ERS中重要的信号分子之一，可通过调控下游分子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)，引发多种组织细胞的凋亡[7]，从而对机体代谢产生影响。然而，牙周炎能否通过PERK-CHOP信号通路调控内脏脂肪细胞凋亡，目前尚未见报道。本实验拟采用P.gingivalis-LPS诱导大鼠慢性牙周炎，观察以睾周脂肪组织为代表的内脏脂肪组织中PERK-CHOP信号通路的改变，检测睾周脂肪细胞凋亡的变化，为进一步研究牙周炎对内脏脂肪组织功能的影响提供动物学研究证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠20只(购于广东省医学实验动物中心)，体质量250～300 g，8周龄，SPF级。根据随机数字表法均分成实验组和对照组，每组10只，使用金属耳标标记。实验大鼠5只一组，分笼饲养，定期观察。喂养过程保持动物原有习性，维持其日常生理状态，每周换水和饲料两次，适应性喂养1周后进行实验。本研究经过广州永诺医学实验动物中心动物伦理委员会审核(SYXK(粤)：2018-0186)，符合动物保护、动物福利和伦理原则。

1.2 试剂与仪器

P.gingivalis-LPS(InvivoGen，美国)，一抗PERK(ab229912)、CHOP(ab179823)、Caspase-12(ab62484)、Cleaved-Caspase-3(ab184787)(Abcam，美国)，p-PERK(3179S)(CST，美国)，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(G3250)(Promega，美国)，微量注射器(7633-01)(Hamilton，瑞士)，4-0医用丝线(强生，中国)，病理组织包埋机(EC1150C型)(徕卡，德国)，光学显微镜(BX41TF型)(奥林巴斯，日本)，Micro-CT机(sky1172)(Bruker，德国)。

1.3 建模与分组

实验组大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥钠，麻醉后观察大鼠呼吸情况，并用丝线勾拉舌向外，以免舌体后坠引起窒息死亡。使用尼龙绳牵拉四肢并将大鼠仰面稳定于动物固定板上。利用丝线充分牵拉上下切牙以暴露口腔环境。操作过程中严密观察大鼠的呼吸、心跳情况。用持针器加持4-0丝线，分别从双侧上颌第二磨牙近远中邻面压入牙颈部，丝线两端打结于腭侧牙颈部。使用牙龈分离器将丝线及结节压入龈沟内。同时用微量注射器注射5 μL 4 g/LP.gingivalis-LPS至龈沟内。

对照组大鼠麻醉后龈沟内注射5 μL PBS。两组小鼠注射频率为一周2次，共建模3个月。建模过程每周2次检查口内丝线情况，若发现脱落，及时重新结扎。

1.4 建模效果评价

本实验分别于结扎前(基线)及结扎后3个月记录牙龈出血指数(gingival bleeding index，GBI)和牙周袋探诊深度(probing pocket depth，PPD)。GBI测量方法如下：使用尖端半径为0.2 mm的牙周探针探测双侧上颌第二磨牙龈沟10 s，根据Liu等[8]的分类计分，0=正常牙龈；1=轻微炎症，探之不出血；2=轻度炎症，牙龈发红、无水肿、探之点状出血；3=中度炎症，牙龈发红、轻度水肿、出血滞留龈沟；4=重度炎症，牙龈发红、重度水肿、出血溢出龈沟；5=严重炎症，牙龈发红明显、严重水肿、自发性出血和溃疡。PPD测定方法如下：使用牙周探针探查双侧上颌第二磨牙近颊、颊侧中点及远颊3个位点龈缘到龈沟底的距离[8]，取平均值记录。大鼠处死后行上颌骨Micro-CT检测，测量双侧上颌第二磨牙近远中釉牙骨质界(cemento-enamel junction，CEJ)至牙槽嵴顶(alveolar bone crest，ABC)的距离(CEJ-ABC)。综合上述指标，评价牙周炎建模效果。

1.5 TUNEL染色检测睾周脂肪细胞凋亡水平

大鼠的内脏脂肪细胞主要分布在睾周、肠系膜周围、肾周三个部位。睾周脂肪组织具有血管分布少、解剖结构清晰及取材方便等特点，在既往研究中常用来代表内脏脂肪组织[9-10]，因此本研究选取睾周脂肪组织作为内脏脂肪组织的代表进行取材。两组大鼠睾周脂肪组织切片脱蜡脱水，PBS漂洗，加入3% H2O237 ℃孵育40 min，PBS漂洗，加入蛋白酶K孵育10 min，PBS漂洗。按照试剂盒说明书说明，将TUNEL混合物置于切片，37 ℃孵育30 min，漂洗，DAB显色，苏木素复染，脱水至透明，封片。图像分析系统分析病理图片，在200倍光镜视野下，随机选取5个视野，胞核染成绿色标记为凋亡细胞核数，胞核染成蓝色标记为细胞核总数。根据尹忠浩等[11]的研究，计算睾周脂肪细胞凋亡百分率=凋亡细胞核数÷细胞核总数×100%。

1.6 Western blot检测PERK、p-PERK、CHOP、Caspase-12、Cleaved-Caspase-3蛋白表达

两组大鼠取100 mg睾周脂肪组织提取蛋白，冲洗后破碎，置于干冰上加入裂解液，12 000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清液，测定蛋白浓度，-80 ℃保存备用。50 μg/孔，电泳，孵育一抗PERK(1∶1 000)、p-PERK(1∶1 000)、CHOP(1∶1 000)、Caspase-12(1∶500)、Cleaved-Caspase-3(1∶1 000)，4 ℃过夜，次日洗膜，孵育二抗(1∶5 000)，电子凝胶成像系统显影、拍照，Image J软件进行蛋白条带定量分析，以β-actin为内参，以目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值表示目的蛋白相对表达量。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 牙周炎模型效果评价

建模3个月后，实验组大鼠牙龈呈深红或暗红色，伴轻到重度水肿，探诊出血甚至溢出龈沟。而对照组大鼠牙龈色粉，质韧，探诊无出血。两组大鼠双侧上颌第二磨牙GBI指数和PPD的测量结果见表1。对照组大鼠3个月时与基线值相比，GBI和PPD差异无统计学意义(P>0.05)，而实验组大鼠结扎3个月时GBI与PPD较基线时明显升高(P<0.05)。

表1 大鼠双侧上颌第二磨牙GBI、PPD比较Tab.1 The comparison of GBI and PPD of the bilateral maxillary second molar of rats

使用Micro-CT对大鼠双侧上颌骨进行扫描，使用Micro-CT自带软件截取上颌骨矢状面图像并进行参数测量。以CEJ至ABC的距离作为牙槽骨吸收的参考标准，计算两组CEJ-ABC距离数值。与对照组对比，实验组双侧上颌第二磨牙近远中牙槽骨出现明显吸收，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1)。大鼠牙周炎模型构建成功。

2.2 大鼠睾周脂肪细胞TUNEL染色情况

对照组睾周脂肪细胞中绿色颗粒较少，而实验组中可见大量绿色颗粒，与对照组相比，实验组大鼠睾周脂肪细胞凋亡率显著升高(P<0.05)(图2)。

2.3 大鼠睾周脂肪细胞PERK、p-PERK、CHOP蛋白表达水平

与对照组相比，实验组睾周脂肪细胞PERK蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，但p-PERK、CHOP蛋白表达水平显著升高(P<0.05)(图3)。

2.4 大鼠睾周脂肪细胞中Caspase-12、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平

与对照组相比，实验组睾周脂肪细胞中Caspase-12、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)(图4)。

3 讨 论

慢性牙周炎的主要毒力因子P.gingivalis-LPS[12]可通过破溃的牙周袋内上皮进入血循环到达远隔器官，从而加重糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病等[13-14]。本实验通过构建牙周炎动物模型，以睾周脂肪组织为代表，探讨牙周炎对内脏脂肪组织功能的影响。

牙周袋内注射P.gingivalis-LPS诱导慢性牙周炎是常用的牙周炎动物建模方法，广泛应用于研究牙周炎与全身健康的关系。本实验采用该方法构建大鼠牙周炎模型，建模3个月后，实验组大鼠出现明显的牙龈红肿出血、 深牙周袋形成及牙槽骨吸收的症状，模拟了人类慢性牙周炎的疾病表型。

既往研究证实，P.gingivalis-LPS是诱导组织细胞凋亡的关键毒力因子，可引起全身各种细胞如心肌细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞的凋亡，参与糖尿病、心血管类疾病等慢性疾病的发生发展[15-17]。本研究通过P.gingivalis-LPS诱导大鼠慢性牙周炎，采用TUNEL染色及蛋白定量分析技术，发现大鼠睾周脂肪细胞发生凋亡。Lv等[18]体外研究发现，P.gingivalis-LPS也可诱导内脏脂肪细胞的凋亡，加重细胞炎症反应，与本研究结果一致。

ERS是细胞受到外界刺激时的早期应激反应，在维持内环境的稳态方面发挥重要作用[19]。大量研究证实，ERS可参与调控牙周组织的破坏和细胞坏死，促进牙周炎的发展[20-21]。另一方面，也有文献报道牙周炎可通过ERS加重对全身系统疾病的作用，如肝脏损伤、糖尿病、动脉粥样硬化等[22]。可见，ERS与牙周炎两者关系密切。然而，牙周炎能否通过ERS调控内脏脂肪组织的功能，目前尚未见报道。本课题组在前期体外实验中发现，牙周炎来源的P.gingivalis-LPS可激活内脏脂肪细胞的ERS[6]，提示牙周炎可能存在调控内脏脂肪组织ERS的潜能。在ERS发生过程中，PERK是一个关键的信号分子，它的磷酸化激活，可诱导下游蛋白CHOP的表达，最终引发细胞凋亡[23]。Bai等[24]研究也证实P.gingivalis-LPS可激活ERS相关的PERK-CHOP通路诱导牙周膜细胞凋亡。本研究中，实验组p-PERK表达上调，其下游蛋白CHOP的表达也相应升高，表明P.gingivalis-LPS诱导的慢性牙周炎可导致睾周脂肪细胞PERK-CHOP通路的激活。PERK-CHOP通路激活诱导的细胞凋亡还与Caspase-12及Cleaved-Caspase-3密切相关[25-26]。Caspase-12可通过引起钙稳态失调激活Caspase-9，继而裂解Caspase-3，形成Cleaved-Caspase-3[27-29]。而Cleaved-Caspase-3是下游蛋白酶级联反应的重要启动因子，其表达进一步加重细胞凋亡[30]。在本研究中，通过检测睾周脂肪组织发现，Caspase-12和Cleaved-Caspase-3在牙周炎大鼠的表达明显上调。由此可见，PERK-CHOP通路在牙周炎诱导的睾周脂肪细胞凋亡中发挥了重要作用。

综上所述，本研究通过构建体内模型证实，P.gingivalis-LPS诱导的牙周炎可调控PERK-CHOP通路，引起Caspase-12和Cleaved-Caspase-3的表达升高，诱导睾周脂肪细胞的凋亡。但P.gingivalis-LPS调控睾周脂肪细胞凋亡的具体机制还需进一步通过体外细胞实验和体内敲除实验来验证。