耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的基因型和同源性分析

贾磊 陆锦琪 冯勤丽 蔡莹 高雯洁

1 嘉兴市第一医院感控与公共卫生部，嘉兴 314001；2 嘉兴市疾病预防控制中心微生物检验科，嘉兴341001

肺炎克雷伯菌是医院感染常见的病原微生物之一，而耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)是引起医院感染的一个重要致病菌，CRKP 感染是引起患者死亡的危险因素之一[1]。 有关研究表明患者使用的机械通气设备、留置导尿、动静脉插管、 气管插管、 床头桌、 监护仪表面以及输液泵分离出的CRKP 与患者感染的CRKP 具有同源性[2-3]，但是因果关系尚不明确。 本研究采用前瞻性的分析，于 2021 年1—8 月对某医院内患者体内和环境样本中检测到的CRKP 进行同源性分析，探求二者之间的因果关系，并检测了CRKP 的耐药基因型，现报告如下。

材料与方法

一、材料来源

收集 2021 年 1—8 月，在某医院 ICU、急诊 ICU、神经外科和呼吸科就诊患者的痰液、血液、尿液、创面等样本中检测出的CRKP。 同时监测CRKP 住院患者所在病房中可能交叉传播区域的物体表面、医疗器材、医用织物以及医务人员的手等。 物体表面包括门把手、床栏、床头桌、治疗车台面、呼吸机面板、监护仪面板、监护使用的相关导线、输液泵／微量泵面板、护理桌面、听诊器、血压器袖带、呼吸机进／出气口、简易呼吸器和湿化罐等。

二、样本采集

对CRKP 感染的住院患者周围环境进行清洁消毒前采样，采样类别以物体表面和医疗器材为主以及患者所在科室工作人员的手指。 患者的临床样本为当患者发生感染时送检的临床微生物样本。 按照《医院消毒隔离技术规范》要求，使用500 mg/L 的含氯消毒液对地面进行终末消毒1 周后，继续筛查患者分离出的CRKP。 本研究通过嘉兴市第一医院医学伦理委员会批准（伦理审批号：LS2018-179）。

三、仪器及试剂

Phoenix-100 全自动微生物分析仪及配套革兰阴性菌的鉴定、药敏卡片购自美国BD 公司。 药敏纸片为英国OXOID公司产品，脉冲场凝胶电泳（PFGE）及相关试剂购自美国 Bio Rad 公司。 碳青霉烯酶检测试剂盒(胶体金免疫层析法)为购长沙众捷物技术有限公司， 检测结果与PCR 检测结果对比，灵敏度与特异性均为100%。

四、药物敏感性实验

抗菌药物敏感性实验采用MIC 法，其中美罗培南的药敏试验使用纸片扩散法。 质控菌株采用卫生部生物制品鉴定所生产的大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。根据2019 年美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准判读菌株对抗菌药物的敏感性[4]。

五、耐药基因型检测

使用碳青霉烯酶检测试剂盒(胶体金免疫层析法)，检测常见的产 KPC、OXA-48、VIM、IMP 和 NDM 等 5 类碳青霉烯酶耐药酶型。

六、PFGE

按肺炎克雷伯菌PFGE 标准操作规程进行， 用XbaⅠ内切酶37 ℃酶切4 h 后上机电泳19 h，初始转换时间6 s，终末转换时间36 s，电压梯度6 V/cm，夹角:120°线性，起始电流：140 mA，电泳 20 h。 成像后用 BioNumerics 6.6 软件分析。 根据相关研究在解释PFGE 结果时，将具有85%以上相同条带的菌株认为是基因型别相同的菌株[5]。

结 果

一、一般情况

2021 年 1—8 月，共分离出 40 株 CRKP 菌株(排除重复分离出的菌株)，其中35 株分离自患者的临床样本（27 株为消毒前，8 株为消毒后），5 株分离自重症医学科和重症康复科的环境和物体表面（均为消毒前），工作人员手上以及清洁消毒后患者周围环境中均未检测出CRKP。

35 株分离自患者的CRKP 临床样本分布： 痰液26 株、引流液3 株、创面2 株、血液4 株；重症医学科25 株、重症康复科4 株、神经外科 3 株、呼吸科 2 株、肝胆胰外科 1 株。 35 例患者中，男性 21 人，女性 14 人；年龄最大 91 岁，最小 29 岁，中位年龄为71 岁；脑外伤及脑出血13 例，重症肺炎9 例，恶性肿瘤7例。

5 株分离自环境的CRKP 中，2 株来自重症康复科，分别为吸氧面罩和床头柜；3 株来自重症医学科，分别为呼吸机管路、微泵以及吸痰管接头。

二、CRKP 耐药基因型别

40 株 CRKP 的耐药基因型分别为：KPC 型 36 株，OXA-48 型 3 株，NDM 型 1 株，其中环境和物体表面分离出的 5 株CRKP 耐药基因型均为KPC 型。

三、CRKP 的同源性分析及药物敏感性

对11 株CRKP 药敏结果高度一致的菌株进行PFGE 同源性分析，结果见图1，11 株CRKP 耐药基因型均为KPC 型。PFGE 分子分型聚类分析显示，3 株来自消毒前重症医学科、1 株来自重症康复科、5 株来自环境和物体表面(床头柜、呼吸机管路接口、微泵、吸痰管接头、吸氧面罩)，以上9 株CRKP的条带相似性为100%。

环境清洁消毒前，4 株从患者体内分离出的CRKP、5 株从环境中分离出的CRKP，PFGE 分析条带100%相同。 在常规的环境清洁消毒前，虽然采样时间不同，但是重症医学科的3 株来自患者痰液和引流液的CRKP 与重症康复科的1株来自患者创面的CRKP， 与周围的环境和物体表面检出的CRKP 具有同源性。

在对重症医学科环境和物体表面消毒后， 菌株编号为8和11 的患者体内分离出的CRKP，与加强环境清洁消毒前4株从患者分离出的CRKP、5 株从环境中分离出的CRKP 的条带相似性在90%以上，具有高度同源性。

11 株CRKP 的药敏结果：除对替加环素和复方磺胺甲噁唑敏感外，对其他抗菌药物均耐药。

四、CRKP 感染患者的治疗和预后

6 例患者在进行微生物培养前均进行了经验性用药，后根据药敏结果及时调整用药，5 例患者治愈出院，1 例患者因住院时重型颅脑损伤而死亡。

讨 论

有关研究表明，CRKP 在环境中存活时间较长，表明环境清洁在预防 CRKP 院内传播方面具有重要作用[6]。 本次研究发现，在重症康复科病房CRKP 感染患者的吸氧面罩、床头柜，重症医学科病房患者的呼吸机管路、微泵以及吸痰管接头中均分离出CRKP。 相关研究显示，病房内的床单位(包括病床、床垫、床栏、床头柜等)一旦被CRKP 污染，会极大增加下一位患者感染的风险[7]。 本研究也证实了这一观点，患者4在2021 年2 月份住重症医学科29 床， 经过合理治疗出院后， 可能是由于终末消毒不到位， 导致患者1 同样感染了CRKP。 同时，当患者感染CRKP 后，治疗需要进行吸痰等操作，导致患者周边的环境也会分离出CRKP。 本研究中，患者使用的医疗器械以及家具均分离出了CRKP， 而且和患者体内分离出的CRKP 具有同源性。 因此，应加强对患者周围环境、床单元清洁消毒工作，这对预防 CRKP 院内传播方面起着重要作用[6]。 虽然本次研究未从相关科室的工作人员的手上检测出CRKP，但仍需引起重视，von Lengerke 等[8]的研究表明，提高手卫生依从性，可以有效降低多重耐药菌的传播。

本文分离出的40 株CRKP 耐药基因型以KPC 型为主，占比高达90%，这和邵春红研究结果类似[9]。 11 株药敏结果高度一致的CRKP 菌株除对替加环素和复方磺胺甲噁唑敏感外，对其他抗菌药物均耐药。 相关研究表明，KPC 耐药基因型以及不同种类抗菌药物的使用是影响CRKP 耐药率的重要因素[10-11]。

另外，本文结果还显示，虽然加强了环境的清洁消毒，但消毒后患者体内分离出的2 株CRKP 与消毒前4 株患者体内、5 株环境中分离出的CRKP 条带相似性仍在90%以上，具有高度的同源性，说明CRKP 可能通过其他途径传播，因此，需要采取集束化干预措施，包括抗菌药物管理、提高手卫生依从性、加强环境的清洁消毒等，以上措施对减少CRKP 在医院内的传播会起到关键作用。

本次研究的局限性为单中心研究， 只能说明本单位的CRKP 耐药基因型。 另外，本研究使用的是传统经典的PFGE鉴定CRKP 的同源性，存在一定的局限，今后计划使用二代基因测序鉴定，提高结果的精准度。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明贾磊：论文撰写，数据收集；陆锦琪：论文指导，学术指导；冯勤丽、蔡莹：环境样本采样；高雯洁：实验分析