壮药白花九里明提取物对大鼠子宫纤溶系统的影响

杨 宏 那袭雪 韩 璐 宋 丹 谈远峰 韦 威 张文涛 宁小清

壮药白花九里明提取物对大鼠子宫纤溶系统的影响

杨 宏 那袭雪 韩 璐 宋 丹 谈远峰 韦 威 张文涛 宁小清

（广西中医药大学，广西 南宁 530200）

目的：通过对大鼠子宫病理切片的观察以及检测子宫组织中tPA，PAI-1的表达，探讨壮药白花九里明提取物在纤溶系统方面的止血机制。方法：对健康的成年或未妊娠雌性老鼠构建不完整子宫流产模型，然后随机分成5组，每组10只，依次是白花九里明提取物低用量，白花九里明提取物中用量，白花九里明提取物高剂量，空白，模型，咖啡酸组6组。取子宫组织。进行组织病理切片的观察，并用免疫组化的方法测定子宫组织中tPA，PAI-1的表达。结果：tPA组经过方差齐性检验，=0.092＞0.05，方差齐。使用单因素方差分析进行两两比较，与正常组比较，模型组和和白花九里明低剂量组tPA水平均显著增加，＜0.05。与模型组比较，咖啡酸组、白花九里明低剂量组、白花九里明高剂量组tPA水平显著降低，＜0.05。白花九里明低剂量组和高剂量组之间比较，高剂量组较低剂量组tPA水平显著降低，＜0.01。PAI-1组经过方差齐性检验，=0.056＞0.05，表明方差齐。与正常组比较，白花九里明低剂量组PAI-1水平均显著增加，＜0.05。与模型组比较比较，咖啡酸组，白花九里明低剂量组、高剂量组PAI-1水平均显著增加，＜0.05。结论：白花九里明提取物具有促进子宫止血的作用，其机制可能与调节子宫纤溶系统相关。

白花九里明；子宫；病理切片；tPA；PAI-1

引言

随着我国“二胎”“三胎”政策的开放，产妇尤其是高龄产妇比例大幅度升高。我国孕妇、产妇的死亡率不断上升。而产后出血正是导致死亡发生的首要原因。因此，如何促进出血后的止血，减少并发症的危害，已成为亟待解决的问题。壮药白花九里明来源于菊科艾纳香属植物东风草［(Randeria)Chang et Tseng］的地上部分，壮族民间常用于治疗产后出血过多[1]。本课题组前期实验表明壮药白花九里水煎液具有止血作用，且具有多靶点、多通路的特点，表现在具有可以增加大鼠子宫平滑肌的收缩活力、收缩频率和平均张力，从而促进子宫收缩而应用于妇产科止血[2]。增加血小板细胞的数量、聚集性以及粘附性。影响大鼠凝血酶原时间、影响活化部分凝血酶持续时间、凝血酶时间和纤维蛋白原也等[3,4]。前期研究还表明，咖啡酸为白花九里明发挥止血作用的有效成分，为了进一步明确白花九里明的妇科止血机制，本实验拟通过造大鼠产后出血模型，并用咖啡酸以及白花九里明干预后，观察大鼠子宫组织的病理影响和测量子宫组织中t-PA、PAI等来说明壮药白花九里明提取物对大鼠纤溶系统的影响。

1 材料

1.1 药材药品与提取物

白花九里明药材采自南宁市市郊，经广西中医药大学朱毅麟高级实验师鉴定为菊科艾纳香属植物东风草［(Randeria)Chang et Tseng］地上部分。提取物由药材加水超声提取，滤过，滤液浓缩后加入乙醇使含醇量为70%～85%，静置，滤过，滤液干燥后即得。

1.2 试剂

咖啡酸片（德州德药制药有限公司，批号：H 37020537）；米非司酮片（湖北葛店人福药业有限公司，批号：H 20033551）；米索前列醇片（湖北葛店人福药业有限责任公司批号：H 20073696）；水合氯醛（天津市大茂化学试剂厂，批号：302-17-0）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：10009218）二甲苯（国药集团化学试剂有限公司，批号：10023418）；3%H2O2（国药集团化学试剂有限公司，批号：10011218）；封闭山羊血清（Solarbio批号：SL038-10 mL）；DAB显色试剂盒（Solarbio批号：DA1010-2*3 mL）；苏木素（Solarbio批号：G1140）；中性树脂（Solarbio批号：G8590）。

1.3 实验动物

Wistar大鼠，SPF级，雌雄比例为1∶1，动物许可证号：SCXK（湘）2016-0011，采购于长沙市天勤生物技术有限公司。试验前，对动物适宜喂食一个星期。

1.4 仪器

P2、P10、P20、P100、P200、P1000正置显微镜（上海市徕卡显微系统股份公司）；DHG-9023A移液管（吉尔森P型移液管股份公司）；TKD-TSB恒温电烤箱（上海市恒一科学仪器股份公司）；TB-718D组织脱水机（湖北康强医疗仪器公司）；RM2235石蜡包埋法机械（湖北省泰维科学实业股份公司）；TB-718L石蜡切片机（美国徕卡显微系统股份公司）；TKD-TK生物组织包埋机械-冷冻机（美国泰维科技公司）；P2、P10、P20、P100、P200、P1000摊片烤片机（湖北省康强医疗仪器公司）；BSA224S型电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。

2 方法与结果

2.1 动物造模

参照王晓东等的方法[5]造模。选择重量为250 g～300 g的Wistar老鼠，雌雄比例各半，SPF级，首先选择正在动情期老鼠，按雌性-雄性1∶1的比率合笼，在第二天上午进行女性阴道涂片试验，在显微镜下若看到有精液或阴道内栓即为怀孕第一天，再选择二十只尚未怀孕的老鼠，作为空白对照组，最后选择已妊娠的成功老鼠一百只，随即分成五组，每组二十只，进行灌胃给药。即模型组、阳性组（咖啡酸10 mg/kg）白花九里明高（9.6 g/kg），中（4.8 g/kg），低（2.4 g/kg）剂量组。各组分别在怀孕第七天，在上午八点灌胃治疗用米非司酮水溶液（12 mg/kg）和晚上六点灌胃米索前列醇水溶液（120 µg/kg），以形成早孕大鼠的不完全流产或子宫内出血模型。持续给药七日。

2.2 取材

最后一次给药后2 h，所有大鼠以3 mL/kg大麻醉剂量腹腔内注射10%的水合氯醛进行麻醉，取出子宫组织，置于4%多聚甲醛中固定，经过包埋、切片、脱蜡、复水等过程，再经伊红-苏木素（HE）染色，用于组织病理学检测；按照免疫组化的方法测定tPA和PAI-1的表达，显微镜观察拍照。

2.3 结果判定

PAI-1、tPA的染色阳性表现，以细胞质内和细胞膜内存在褐黄色颗粒且强度超过背景值为准，在拍摄的四百倍镜下具有典型细胞染色区域。依染料深浅确定阳性强弱，在光镜下逐张切片分析图像，估计每单位体积的染色区域平均光密度（mean opticaldensity，mean OD），取平均值代表蛋白的相对表达水平，用光密度值除以面积，来测定单位面积处的平均光密度值。

2.4 统计学处理

使用spss.21应用软件完成统计分析数据，结论以均数的±标准差（±）显示，采取配对检测的方式进行检验；组间对比使用单因方差分析，当数据结果不符合正态分配或方差齐性时，则使用秩和检验分析的方法，组间两两对比采用Mann-Whitney U检验分析。检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 白花九里明提取物对大鼠子宫组织的影响

白花九里明提取物对大鼠子宫组织的影响如图1所示，a为正常组子宫，其内膜细胞结构完整，粘膜层内腺体细胞核、细胞形态均正常，核排列整齐且朝向基底膜，间质细胞分布密集，b为模型组内膜细胞不完整，腺体细胞排列疏松且不规则，部分核皱缩甚至消失，血管数量减少，有水肿以及炎细胞浸润，与正常组相比有明显差异，表明造模成功。c为咖啡酸组较模型组腺体细胞趋于正常，血管数量明显增加，子宫内膜相对完整；d为白花九里明低剂量组整体腺体疏松不规则，血管数量增加，e、f为白花九里明中、高剂量组与模型组相比，肌层细胞排列紧密，腺体细胞趋于正常，渗出物减少。

a正常组；b模型组；c咖啡酸组；d百花九里明低剂量组；e百花九里明中剂量组；f百花九里明高剂量组

3.2 白花九里明提取物对大鼠子宫组织tPA和PAI-1的影响

运用免疫组化的方法测量子宫组织中tPA和PAI-1的含量如图2、图3所示，用Image ProPlus半定量法计算tPA和PAI-1的表达量如表1所示。

a正常组；b模型组；c咖啡酸组，d百花九里明低剂量组；e百花九里明高剂组

a正常组；b模型组；c咖啡酸组，d百花九里明低剂量组；e百花九里明高剂组

表1 白花九里明提取物对不完全流产大鼠模型子宫组织tPA和PAI-1的影响（±，n=6）

表1 白花九里明提取物对不完全流产大鼠模型子宫组织tPA和PAI-1的影响（±，n=6）

平均光密度 IOD tPAPAI-1 空白组0.111±0.0230.076±0.018 模型组0.133±0.019#0.053±0.018 咖啡酸组0.107±0.006*0.092±0.024** 白花九里明低剂量组0.115±0.103*0.104±0.012**# 白花九里明高剂量组0.084±0.015**#0.102±0.017**

注：*＜0.05，**＜0.01与模型组比较，#＜0.05，##＜0.01与空白组比较。

tPA组经过方差齐性检验，＝0.092＞0.05，方差齐。使用单因素方差分析进行两两比较，与正常组比较，模型组和和白花九里明低剂量组tPA水平均显著增加，＜0.05。与模型组比较，咖啡酸组、白花九里明低剂量组、白花九里明高剂量组tPA水平显著降低，＜0.05。白花九里明低剂量组和高剂量组之间比较，高剂量组较低剂量组tPA水平显著降低，＜0.01。

PAI-1组经过方差齐性检验，=0.056＞0.05，方差齐。与正常组比较，白花九里明低剂量组PAI-1水平均显著增加，＜0.05。与模型组比较比较，咖啡酸组、白花九里明低剂量组、高剂量组PAI-1水平均显著增加，＜0.05。

4 讨论

纤溶系统，也叫纤维蛋白溶系统。主要功能是清除凝血物质系统的必要产物。纤溶酶可血栓，在止血过程中发挥着很大功效。tPA一般由血管内皮细胞形成，以极微量溶液浓度出现于血浆中。在血管内，丝氨酸蛋白凝血酶将可溶性纤维蛋白原转换成不溶性纤维蛋白，纤维蛋白原在纤溶的作用下溶解[6]，tPA还能够使纤溶酶原转换为纤溶酶，以实现催化毛细血管内纤维蛋白降解的目的，而PAI-1主要是在血浆中以极微量的溶液含量出现，由包括毛细血管内皮细胞、平滑肌舒张细胞、脂肪细胞和肝细胞等多种细胞分泌[7,8]。PAI-1通过抑制tPA和uPA而抑制纤溶酶形成，从而抑制纤溶。在正常生理状态下，纤溶酶原激活剂和抑制剂维持动态平衡，从而维持凝血和溶血的平衡。所以，目前临床常采用测量组织型的纤维蛋白质溶系统酶原活化物（tPA）和纤维蛋白质溶解性酶原活化物控制纤因子（PAI-1）来说明纤维蛋白溶解系统[9]。

产后出血的主要包括因产后子宫复旧不全、胎盘残留、子宫内膜炎等所致的产后出血以及流产所致的出血。其发生的原因主要有子宫收缩乏力、组织残留、创伤以及凝血障碍，其中凝血功能障碍是导致产后出血的重要原因。这表明妇女在妊娠期凝血-纤溶的改变被认为为引起产后出血的一个重要原因。梁荣伟等[10]研究表明纤溶酶的异常与产后出血量有关系。纤维蛋白过高或者过低都能引起产后出血。孙孟甜[11]等表明纤溶系统的异常与复发性流产存在相关性。传统医学认为白花九里明具有散瘀止血、祛风除湿的功能。常用于治疗血瘀崩漏、温痹痛、跌打肿痛等，在壮族民间常用水煎液进行妇科止血。产后出血在传统医学中又称产后恶露不绝。其发病机理不论血瘀型、气虚血瘀型、瘀热互结型[12]均不外乎“瘀”。淤血阻滞冲任二脉，新血不得归经，从而使恶露过期不止。其治疗手法也常以祛瘀为先，这同样表明纤溶系统在止血过程中发挥的重要作用。因此，观察产后出血纤溶系统的变化，可以反映体内凝血系统的激活状态，从而减少产后出血孕妇的死亡率。

5 结论

本实验结果表明，不完全流产大鼠子宫出血后内膜破损，细胞核皱缩、变小、甚至自溶，而白花九里明提取物可以促进修复子宫内膜，收缩平滑肌细胞，增加血管数量从而促进产后子宫复旧，改善血流不止的情况。从纤溶系统来看，造模后tPA和PAI-1水平均有升高。而正常大鼠子宫中tPA和PAI-1含量很低。表明造模后，大鼠子宫出血，引起纤溶增加，而白花九里明提取物给药干预后，tPA水平显著下降，但PAI-1水平上升，这表明高剂量白花九里明可以降低纤溶系统的活性，提示白花九里明提取物可以通过调节不完全流产大鼠子宫中纤溶系统的活性，调节纤溶/抗纤溶的平衡，从而达到止血的目的。

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Effect of Zhuang Medicine(Randeria) Chang et Tseng Extract on Uterine Fibrinolytic System in Rats

Objective: To investigate the hemostatic mechanism of Zhuang medicineextract in fibrinolytic system by observing the pathological sections of rat uterus and detecting the expression of tPAand PAI-1 in uterine tissue. Methods: An incomplete uterine abortion model was established in healthy adult or non pregnant female mice, and then randomly divided into five groups, with ten mice in each group. The order was 6 group of low dosage of(Randeria) Chang et tseng extract, medium dosage of(Randeria) Chang et tseng, high dosage of(Randeria) Chang et tseng extract, blank, model and caffeic acid group. Uterine tissue was taken. The expression of tPA and PAI-1 in uterine tissue was determined by immunohistochemistry. Results: TPA was tested by homogeneity of variance,=0.092＞0.05, and the variance was homogeneous. One way variance was used for pairwise comparison. Compared with the normal group, the TPA levels of the model group and the low-dose group of(Randeria) Chang et tseng were significantly increased,＜0.05. Compared with the model group, tPA levels in caffeic acid group, low-dose group of(Randeria) Chang et tseng and high-dose group of(Randeria) Chang et tseng were significantly decreased,＜0.05. Compared with low-dose group and high-dose group of(Randeria) Chang et tseng, tPA level in high-dose group was significantly lower than that in low-dose group,＜0.01. PAI-1 group passed the homogeneity test of variance，=0.056＞0.05，and the variance was uniform. Compared with the normal group, PAI-1 levels in the low-dose group of(Randeria) Chang et tseng was increased significantly,＜0.05. Compared with the model group，PAI-1 levels in caffeic acid group，low-dose group and high-dose group of(Randeria) Chang et tseng increased significantly,＜0.05. Conclusion: The extract of(Randeria) Chang et tseng has the effect of promoting uterine hemostasis, and its mechanism may be related to the regulation of uterine fibrinolytic system.

Blumea megacephala (Randeria) Chang et Tseng; uterus; pathological section; tPA; PAI-1

R285

A

1008-1151(2022)10-0084-04

2022-08-15

广西中医药大学校级一般硕士研究生创新项目（YCSY20190026）。

杨宏（1996－），女，广西中医药大学在读硕士研究生，研究方向为中药民族药药效物质基础及新产品开发。

宁小清（1966－），女，广西中医药大学高级实验师，硕士生导师，研究方向为中药鉴定及质量分析。