胶体金免疫层析试纸条同时检测生乳中吡虫啉、吡唑醚菌酯、氟虫腈残留的研究

陈发荣，金洪伟，韩琰旭，吴月皓，齐 瑜

1 北京艾旗斯德科技有限公司，北京101102

2 深圳市光明区疾病预防控制中心，广东深圳 518106

0 引言

农药是农业生产中重要的因素，牧场草或植物饲料生长过程中有可能使用过农药，但如果控制不好，奶牛通过摄取牧场草或植物饲料生长发育，部分农药可能会被奶牛摄入，通过牛体代谢进入牛乳，从而进入人体代谢，危害人体健康。农药残留是影响乳制品安全的因素之一。国内外毒理学专家通过大量试验证明，生乳中残留的农药进入人体后，对人体健康的危害，为长时期、微剂量、慢性细微毒性效应。会在人体生理、生化或自身免疫功能等方面表现出来，致畸、致癌、致突变[1]。因此，控制生乳中农药残留，严禁具有农药残留风险的生乳进入市场，确保乳品安全，受到日益关注。

《GB2763—2021 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中对生乳中的农药残留做出明确限量规定，具体数据见表1。目前检测农药残留的方法大致有气相色谱[2～4]、液相色谱[5，6]、气相色谱-质谱法[7，8]、液相色谱-串联质谱法[9～11]和酶联免疫吸附法[12]等。但是这些方法均需要进入实验室操作，且操作时间过长，但生乳是新鲜易腐的农产品，如果等实验室的检测数据出来后再判断是否合格，为时已晚，因此收奶员需要用最短的时间判断其是否合格，所以开发快速检测生乳中农药残留的方法在基层使用很有必要；另外由于农药的种类较多，多种农药残留的风险也较大，所以需要开发尽可能多合一的检测方法，以方便快速、全面的排查生乳的农药残留风险。

表1 GB2763—2021中对生乳中农药残留的明确限量规定（部分）

胶体金免疫层析方法在果蔬中的农药残留检测应用很广泛[13～16]，但其在生乳中的农药残留检测鲜少报道。本文利用胶体金免疫层析法开发了多合一的检测试纸条，实现了同时、快速测定生乳中吡虫啉、吡唑醚菌酯、氟虫腈的残留。

1 材料与方法

1.1 仪器设备和材料

1.1.1 仪器

Lab-1A-50E冷冻干燥机，北京博医康技术有限责任公司；HM3030-XYZ三维喷金划膜一体机，上海金标生物技术有限公司；Electron冷冻离心机，Thermo公司；SHZ-82气浴恒温振荡器，金坛市荣华仪器制造有限公司；WH-3漩涡混匀仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；SHZ-82气浴恒温振荡器，荣华仪器设备有限公司；DU640紫外光谱扫描仪，BECKMAN公司。

1.1.2 试剂

氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA），美国sigma公司分装；柠檬酸三钠，上海试剂一厂；聚乙二醇PEG 20000，羊抗鼠IgG（二抗），上海生工生物工程有限公司；吐温（Tween-20），上海精析化工科技有限公司；蔗糖，广东汕头西陇化工试剂厂；海藻糖，上海KAYON公司；PVP底板、结合垫、样品垫、吸水纸，上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维（NC）膜，美国Millipore公司；吡虫啉、吡唑醚菌酯、氟虫腈3 种单克隆抗体，北京艾旗斯德科技有限公司实验室自制；吡虫啉、吡唑醚菌酯、氟虫腈、哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺、嘧菌环胺、克百威、毒死蜱、阿苯达唑、烯酰吗啉、百菌清、腐霉利（纯度均大于99%），中国药品生物制品检定所提供；生乳样品，中国药品生物制品检定所提供。

1.2 胶体金试纸条制备[17，18]

煮金：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，往蒸馏烧瓶中加入100 mL双蒸水，再加入1%氯金酸溶液1 mL，电热套加热至沸腾；迅速加入还原剂（1%柠檬酸三钠溶液）1.7 mL，开始搅拌，待溶液呈酒红色加热稳定5 min，冷却至室温备用。

标记抗体：加入5 μL0.02 mol/L 碳酸钾（K2CO3）溶液调节pH至最佳，加入5 μL 1.0 mg/mL 抗吡虫啉单克隆抗体，震荡混匀，避光2 h，离心7 500 r/min、35 min，弃上清，加入重悬液，得金标抗体喷涂液，待用；吡唑醚菌酯、氟虫腈单克隆抗体标记同法。

混合抗体标记物制备：将三种金标抗体喷涂液按1∶1∶1比例混合，制备出混合抗体标记物，待用。

金标结合垫的制备：将混合抗体标记物均匀喷涂于结合垫上，喷涂量为：10 μL/cm2。

检测线和质控线制备：0.02 mol/L 磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4）将羊抗兔抗体稀释至1.0 mg/mL，划线于硝酸纤维素膜（NC膜）上，作为质控线（C线），用0.02 mol/L 磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4）分别稀释吡虫啉、吡唑醚菌酯、氟虫腈三种全抗原至1.0 mg/mL，形成T1线为氟虫腈结果显示线；T2为吡唑醚菌酯结果显示线；T3为吡虫啉结果显示线，三条检测线，37 ℃烘2 h，待用。

组装试纸条：将样品垫、金标垫（已喷涂抗体）和吸水纸依次组装到附有NC膜的支持底板上，然后用切条机切割成宽度为3.5 mm的试纸条。

1.3 胶体金试纸条性能测试

1.3.1 检测下限测试

首先用PBS稀释标准品以确定初始试纸条检测浓度，浓度见表2。

表2 检测下限测试浓度梯度对照表

各取100 μL标样分别置于微孔杯里，室温孵育5 min，将全部反应液点样于试纸条样品垫上，5 min观察反应情况，每份样品2 个平行。

1.3.2 加标回收测试

取经确定为阴性的生乳加标，浓度见表3。

表3 加标回收测试浓度梯度对照表

各取100 μL生乳分别置于微孔杯里，室温孵育5 min，将全部反应液点样于试纸条样品垫上，5 min观察反应情况，每份样品2 个平行。

1.3.3 与定量检测方法结果对比试验

取25 批次生乳样本，分别用高效液相色谱法测定吡虫啉浓度[20]，用超高效液相色谱串联-质谱法检测吡唑醚菌酯[21]，用气相色谱-质谱法检测氟虫腈[22，23]，同时用胶体金试纸条检测50 批次生乳样本。

1.3.4 稳定性测试

将同一批次试纸条室温置于45 ℃恒温器中保存，每隔1 周检查一次活性，每批重复8组，共计5 周，观察线条的稳定性和保质期，考察其稳定性。

1.3.5 交叉反应测试

确定哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺、嘧菌环胺、克百威、毒死蜱、阿苯达唑、百菌清、腐霉利、烯酰吗啉共10 种农药开展交叉反应测试[19]，浓度配制表4。

表4 稳定性测试浓度梯度对照表

2 结果

2.1 试纸条制备结果

胶体金试纸条采用3 条检测线，分别是吡虫啉、吡唑醚菌酯、氟虫腈，1 条质控线组成。同时检测3 种生乳中农药残留[19，20]。

从图1效果看出冻干粉均匀，图2看出试纸条整齐，适合试验，取100 μLPBS缓冲液置于微孔杯里，室温孵育5 min，将全部反应液点样于试纸条样品垫上，5 min反应结果如图3。

图1 金标抗体冻干粉效果

图2 切割后试纸条状态

图3 试纸条显色示意图

2.2 胶体金试纸条性能测试结果

2.2.1 检测下限测试结果

图4中从左到右对照表1中浓度，结果发现当表1浓度3 种农药的浓度为吡虫啉0.05 mg/kg；吡唑醚菌酯0.025 mg/kg；氟虫腈0.01 mg/kg时，即第7条试纸条显示结果，3 条T线几乎消失，剩下浅浅的印，明显浅于C线，故初步检测下限为：吡虫啉0.05 mg/kg；吡唑醚菌酯0.025 mg/kg；氟虫腈0.01 mg/kg，符合GB2763—2021对生乳中农药残留做出明确限量规定。

图4 检测下限显示结果图

2.2.2 加标回收测试结果

图5对比表2，结果发现，4号试纸条3条T线已经明显变浅，但是为了更加确定的阳性判断，规定5号试纸条对应的浓度为检测下限，即吡虫啉0.05 mg/kg；吡唑醚菌酯0.025 mg/kg；氟虫腈0.01 mg/kg，与初始检测检测限试验结果相符，由于胶体金免疫层析法本身是半定量分析，无法精确计算加标回收率。

图5 加标回收测试结果图

2.2.3 与国标方法结果对比试验结果

表4为胶体胶体金免疫层析试纸条同时检测生乳中吡虫啉、吡唑醚菌酯、氟虫腈残留与国标方法结果对比试验结果，通过结果发现，经过测试的25 个样品，其中吡虫啉项目超过检测下限0.05 mg/kg的5 个样品，胶体金试纸条均已经检出；吡唑醚菌酯项目超过检测下限0.025 mg/kg的4 个样品，胶体金试纸条均已经检出；氟虫腈项目超过检测下限0.01 mg/kg的3 个样品，胶体金试纸条均已经检出；阴性样品均对应符合。定性判断结果与国标检测方法符合率100%，符合对快速检测方法的要求。

表4 结果对比表

2.2.4 稳定性测试

连续检测5周结果（图6）：第1至第5周测试结果显色没有明显变化，根据阿伦尼乌斯公式：25 ℃下保存1 年，相当于37 ℃老化91 天，相当于45 ℃老化37 天。目前试纸条45 ℃保存5周即相当于25 ℃下保存1 年，满足生产使用需要。

图6 稳定性测试图（左起分别为第1至第5周）

2.3.5 交叉反应测试

表5为相似结构的常用农药交叉反应结果，结果发现，当哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺、嘧菌环胺、克百威、毒死蜱、阿苯达唑、烯酰吗啉、百菌清、腐霉利最高浓度均达到2.0 mg/kg时，10 种相似结构的常用农药均无阳性反应，说明这些农药对试纸条的阳性反应没有实质性影响，无交叉反应。由于胶体金试纸条本身为半定量的检测手段，不能精确计算出交叉反应率。

表5 交叉反应测试结果对比表

3 讨论与结论

目前，利用仪器检测生乳中农药残留的方法及文献较多，但利用胶体金试纸条能够同时检测生鲜乳中3 种农药残留的文献较少。本研究通过胶体金免疫层析速测法检测生乳中吡虫啉、吡唑醚菌酯和氟虫腈农药残留，通过比对试验，提高了试纸条的检测下限，本研究发现，吡虫啉微孔法比干条法检测下限提升3 倍左右；吡唑醚菌酯啉微孔法比干条法检测下限提升3 倍左右；氟虫腈微孔法比干条法检测下限提升5 倍左右；检测下限具体为：吡虫啉0.05 mg/kg；吡唑醚菌酯0.025 mg/kg；氟虫腈0.01 mg/kg。每次检测可在50 min内完成一件样品从前处理到测试卡显色读取的全部过程，并用高效液相色谱法、超高效液相色谱串联质谱法、气相色谱质谱法进行验证，相比之下，与国标检测方法符合率100%，符合对快速检测方法的要求；25 ℃下可保存1 年。

通过胶体金试纸条的反应，在T线区域显色，通过判断相应的T线来确定三种农药是否超标，操作简单，快速灵敏，稳定准确；按照《农残办技术材料要求及审查程序》要求，本研究对试纸条特异性、准确性、稳定性等进行了性能测试，均符合要求。可以用于现场的快速检测，检测检测下限符合GB 2763—2021生乳中相应农残的要求，可以作为前期农残检测的快速筛查手段。但是由于农药的种类繁多，还需要持续的开发更多的试纸条检测更多的农药残留。