夹脊电针对兔退变腰椎间盘细胞凋亡的影响

汪 敏，邹 璟，黄国付,3△

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065； 2.武汉市第一医院，湖北 武汉 430022；3.深圳市龙岗区妇幼保健院,广东 深圳 518172)

椎间盘作为脊柱承载系统中最关键的部分，具有传递和吸收脊柱轴向的压缩应力并保持脊柱的多轴灵活性作用，是人体中较早发生退行性改变的组织[1]。以椎间盘退变(Intervertebraldiscdegeneration，IDD)为病理基础的腰椎退行性病变，常常引起腰腿痛及神经功能障碍，严重影响人们的生活质量[2-3]。目前对于IDD的具体发病机制仍不完全清楚，有研究者认为椎间盘细胞凋亡是引起IDD的重要机制之一[4-5]。本研究拟观察夹脊电针对兔退变腰椎间盘组织中Bax、Bcl-2表达的影响，探讨夹脊电针治疗腰椎退行性病变的作用机制，为临床应用夹脊电针治疗腰椎退行性病变提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

本实验由武汉万千佳兴生物科技有限公司提供(合格证编号:No．42000300005952)发育成熟的雄性新西兰大白兔20只，月龄5～6月，体质量约3.5～4.0 kg，所有实验兔在武汉市第一医院中心实验室给予适应性饲养1周后(实验室温度为16～26 ℃；相对湿度40%～60%，每日可接受自然光线>10 h)，再进行随机编号分为正常组、模型组、假模型组和电针组4组，每组5只。正常组给予正常喂养，不予任何处理；模型组在实验兔L4、L5椎体间置入克氏针，连接加压装置，进行椎体间加压28 d，不做治疗；假模型组在实验兔的L4、L5椎体间置入克氏针，不进行椎体间加压，不做治疗；电针组在造模成功后，施以电针治疗28 d。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 仪器 激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)；椎间盘轴向加压造模器(东风汽车设备制造厂)；Signa HDx 3.0T磁共振器(美国通用电气公司)；韩氏穴位神经刺激仪(南京济生医疗科技有限公司)；切片机(上海徕卡仪器有限公司);烘箱(上海福玛实验设备有限公司)；电钻(上海锐奇工具)；针灸针(华佗牌0.30×25 mm)。

1.2.2 试剂 PBS溶液(0.01M)；Anti-Bax antibody (abcam公司,货号ab32503,浓度1∶100)；Anti-Bcl-2 antibody (abcam公司,货号ab182858;浓度1∶100)；DAPI(赛维尔生物，G1012)；抗荧光淬灭剂(谷歌生物，G1401)；CY3标记的羊抗兔IgG(谷歌生物，GB21303，1:300)；FITC标记的羊抗兔IgG(谷歌生物，GB22303，1∶300)；Tunel检测试剂盒(美国Roche公司)。

1.3 建立模型

按照Kroeber M[6]及黄国付[7]等的造模方法。先将实验兔固定于兔固定台，10%水合氯醛(1 mL/kg)沿兔耳缘静脉缓慢推注麻醉，背部备皮，找到实验兔L4、L5椎体椎旁约1.5 cm处，分别做垂直切口，分离椎体前筋膜及肌肉等组织，直至暴露椎体，用直径1.5 mm克氏针垂直刺入两椎体间，利用电钻将克氏针穿透椎体及对侧皮肤，使克氏针保持平衡，最后将轴向加压造模器安装于克氏针两端，施加200 N的压力持续28 d,见图1。术后给予实验兔肌注青霉素4×106U，1次/d，持续5 d。造模第28天后拆除造模装置，用3.0T磁共振器扫描，评估造模效果。

注：轴向压力诱导椎间盘退变模型。

1.4 电针治疗

电针治疗见图2，治疗方法：参照郭义的《实验针灸学》[8]中“实验动物穴位标准定位”，在实验兔L4～5双侧夹脊穴处取穴，用0．30 mm×25 mm针灸针刺入(深度0.5～0.8 cm)，进针后捻转至针下有沉涩感后，连接韩氏穴位神经刺激仪，穴位神经刺激仪强度为1～2 mA，频率为2/15 Hz，1次/d，每次30 min，连续治疗6 d为1个疗程，疗程间隔1 d，共治疗4个疗程。

图2 电针治疗

1.5 观察指标及检测方法

各组实验兔麻醉后行椎间盘MRI平扫，处死实验兔，取出椎间盘组织。通过激光共聚焦显微镜观察实验兔椎间盘组织的Bax、Bcl-2蛋白表达；运用TUNEL染色观察细胞凋亡情况。

1.5.1 MRI检测 在造模后，将各组实验兔麻醉，使用SignaHDx3．0T磁共振仪(GE)行L4～5椎间盘MRI平扫，评估造模效果。通过观察MRI T2像上髓核的信号强度、与椎间隙的高度及纤维环分界情况等指标,按照Pfirrmann[9]体系对实验兔椎间盘MRI信号进行分级。

1.5.2 激光共聚焦检测 将放于孔板中组织取出，去掉培养液，用 PBS 洗涤细胞2次，用4%多聚甲醛溶液固定细胞，室温静置30 min，加入0.1%Triton-X100,室温透膜静置15 min，PBS洗涤3次，5%PBS脱脂乳封闭1 h，加入Anti-Bax 、Anti-Bcl-2 ，避光孵育，经PBS洗涤后，加入CY3标记的羊抗兔IgG、FITC标记的羊抗兔IgG和DAPI染料，室温静置，甘油封片，激光共聚焦显微镜观察。

1.5.3 TUNEL染色及凋亡细胞计数 ①椎间盘组织石蜡切片，脱蜡，浸泡；②加蛋白酶K工作液，室温孵育15 min，PBS(PH7.4)洗5 min×3次；③加破膜工作液，常温孵育10 min，PBS(PH7.4)5 min×3次；④加入Anti-Bcl-2、Anti-Bax，湿盒内孵育60 min；⑤PBS冲洗5 min×3次，加入甲醇双氧水(30%双氧水∶甲醇=1∶9)，常温避光孵育15 min；⑥PBS冲洗5 min×3次,甩去PBS液，加入适量POD，37 ℃水浴锅孵育30 min,PBS(PH7.4)5 min×3次；⑦甩去PBS液，加50～100 μL的DAB溶液，显微镜控制显色；⑧显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染；⑨切片脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固；⑩光镜下观察棕色颗粒的阳性细胞，即凋亡细胞。凋亡指数=有核细胞中阳性细胞数/有核细胞×100%。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组实验兔椎间盘MRI及Pfirrmann分级比较

正常组与假模型组实验兔的椎间盘显示为匀称明亮的高信号，两组信号强度无明显差异；模型组实验兔的L4～5椎间盘信号强度与相邻正常椎间盘信号强度明显降低，表现为黑色,确定造模成功；电针组较模型组的L4～5椎间盘信号强度有部分改善。对各组实验兔MRI信号进行分级，结果显示：与正常组比较，假模型组椎间盘的MRI分级差异无统计学意义(P>0.05)；模型组椎间盘的MRI分级较高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，电针组椎间盘的MRI分级下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1和图3。

表1 4组MRI分级比较

注：A、B、C、D为4组对应MRI矢状位像；F、G、H、I为4组对应MRI轴位像；箭头所标为椎间盘信号改变。

2.2 激光共聚焦观察下各组实验兔Bax、Bcl-2表达比较

激光共聚焦显微镜下阳性显示CY3荧光素标记的为红光(Bax)，FITC荧光素标记为绿光(Bcl-2)，DAPI染的细胞核为蓝色。正常组和假模型组镜下可见少量的Bax蛋白表达，大量的Bcl-2蛋白表达，与正常组相比，模型组可见大量的Bax蛋白表达，少量的Bcl-2蛋白表达；与模型组相比，电针组的Bax蛋白表达较少，Bcl-2蛋白表达较多。用Image J软件对累积光密度值(IOD)进行统计，结果发现：与正常组相比，假模型组的Bax、Bcl-2表达差异无统计学意义(P>0.05)；模型组的Bax表达明显增加，Bcl-2表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，电针组的Bax表达降低，Bcl-2表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2和图4。

表2 Bax、Bcl-2累积光密度值

图4 激光共聚焦观察下各组实验兔Bax、Bcl-2的表达

2.3 各组实验兔椎间盘的TUNEL染色及凋亡细胞计数比较

镜下可见正常组与假模型组有少量的TUNEL染色阳性细胞(凋亡细胞)；模型组的阳性细胞较正常组明显增多;电针组的阳性细胞较模型组稍减少。通过凋亡细胞计数显示，与正常组比较，假模型组实验兔的凋亡细胞阳性数差异无统计学意义(P>0.05)；模型组实验兔的凋亡细胞阳性数明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，电针组实验兔的凋亡细胞阳性数减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3和图5。

表3 凋亡细胞计数

图5 4组实验兔椎间盘的TUNEL染色

3 讨论

椎间盘由髓核、纤维环及上下终板3部分所构成。椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration，IDD)是一种随年龄增长而发生的自然病变的过程。细胞凋亡是为了维持机体器官或组织内环境稳定的一种程序性的细胞死亡模式。椎间盘细胞的大量凋亡使椎间盘内部自我平衡机制破坏，从而加速了退变进程[10]。细胞凋亡包括3条凋亡通路，即线粒体、死亡受体和内质网应激。Tschoeke等[11]认为椎间盘细胞凋亡主要通过线粒体凋亡通路所介导。有研究表明在衰老的NP细胞中，如底物脱氢酶、细胞色素和底物载体的编码基因等与线粒体功能相关基因的表达明显上调，说明在衰老的NP细胞中线粒体功能发生异常[12]。另有报道称[13]Bcl-2家族是调控线粒体凋亡通路的重要蛋白家族。

Bax、Bcl-2作为Bcl-2家族中的促凋亡与抗凋亡蛋白的典型代表，在细胞凋亡中扮演着重要角色。Bax、Bcl-2两者能结合成凋亡二聚体，释放凋亡诱导因子，诱导细胞凋亡[14]。JIANG等[15]在软骨终板细胞中检测到线粒体膜电位的破坏，Bcl-2蛋白的表达水平降低，Caspase-3、Caspase-9、Bax和细胞色素C的表达水平上升。周文明等[16]运用补肾壮督方减少active Caspase-3、cytC和Bax蛋白表达，增加Bcl-2蛋白表达，抑制线粒体凋亡通路，改善椎间盘退变。由此探寻可通过调控Bax、Bcl-2的蛋白表达，抑制椎间盘细胞凋亡，改善椎间盘退变。

腰椎退行性病变属于中医“腰痛”“痹证”范畴，针灸作为中医学的一种治疗手段，具有行气活血、疏通经络的作用。电针是在传统针刺加入脉冲电流，电针在镇痛、改善肌肉及血管痉挛等方面有良好的效应[17]。夹脊穴为经外奇穴，位于督脉与足太阳膀胱经之间，局部刺激夹脊穴能够促进局部的血液运行,有疏通经络的作用。有研究[18]表明电针夹脊穴可以抑制脊髓神经元细胞凋亡，通过提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制促凋亡蛋白Caspase-3、PARP及Bax的表达。前期研究[19]表明电针夹脊通过降低退变的兔椎间盘组织中Bax的表达，促进Bcl-2蛋白的合成，对退变的椎间盘有一定的保护作用。

有研究认为[20]椎间盘内的异常生物力学因素是导致IDD的重要原因。本研究通过轴向压力诱导方法制备实验兔腰椎间盘退变模型，造模28 d后，椎间盘MRI平扫，通过观察椎间盘的信号强度评估造模效果。采用Pfirrmann分级体系观察椎间盘的退变程度，Pfirrmann分级是临床上比较常用的分级标准，常用于术前评估，有研究者[21]通过对Pfirrmann分级不同患者进行治疗，得出Pfirrmann分级越高疗效越差，术后疼痛缓解以及功能障碍的改善与椎间盘退化的程度有关。本实验中与正常组相比，假模型组椎间盘的MRI分级无明显差异，模型组的MRI分级明显升高，电针组MRI分级低于模型组，说明经压力诱导的椎间盘退变分级高，电针夹脊穴能改善椎间盘退变，降低椎间盘MRI分级。本实验采用激光共聚焦观察和TUNEL染色对实验兔椎间盘内Bax与Bcl-2表达和凋亡细胞指数进行检测，结果显示正常组和假模型组的椎间盘Bax、Bcl-2蛋白表达及凋亡细胞阳性数无明显差异，与正常组比较，模型组的Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下降，凋亡细胞阳性数明显增多；与模型组比较，电针组的Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达增加，凋亡细胞阳性数减少。说明退变椎间盘能激活促凋亡蛋白Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，而电针夹脊穴能够上调Bcl-2蛋白，下调Bax蛋白表达，降低凋亡细胞阳性数，从而抑制退变椎间盘的细胞凋亡，延缓椎间盘的退变。

综上所述，电针夹脊穴能降低MRI分级指数，促进Bcl-2表达，抑制Bax表达，抑制椎间盘退变细胞凋亡。本研究通过电针夹脊穴调控凋亡蛋白的表达治疗腰椎间盘退变，为临床治疗该类疾病提供理论依据。