基于中医“同病异治”理论探讨电针刺激对脊髓损伤大鼠的神经再生机制

刘翔宇，魏卫兵，周宾宾

(1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530000；2.广西中医药大学附属第三医院，广西 柳州 545000；3.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530000)

脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)是各种原因引起的椎管内脊髓或者马尾神经的不同程度损伤[1]。据统计，SCI 患者一生的治疗康复费用多达 300万美元以上，在美国每年对 SCI 患者的花费超过40亿美元[2-3]，如何促进损伤后中枢神经修复一直是神经研究领域重点热点课题[4]。电针对于SCI具有一定的修复作用，课题组前期研究结果显示电针刺激可刺激缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor-1ɑ，HIF-1ɑ)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)等相关因子的表达，改善脊髓损伤局部的血氧微环境，为中枢神经轴突再生提供营养支持[5]。以往研究显示蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)是环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP)的主要受体，cAMP/PKA信号通路与神经元之间的轴突连接处神经递质的释放紧密相关，在促进轴突的再生发挥重要作用[6-7]。脊髓损伤中医古称“痿证”，认为“痿证”的发生与气血密切相关，中医“疏通督脉气血”“治痿独取阳明”治则均可起到气血疏通作用[8-10]，符合中医“同病异治”理论，这与课题研究Nogo-A/NgR与NGF/TrkA的crostalk作用调节SCI后神经可塑性有异曲同工之妙。本研究是为课题研究的关键部分，对于进一步探讨电针刺激对脊髓损伤后神经再生修复具有重要意义,同时对于阐释中医“同病异治”理论的现代医学内涵具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 实验所需60只健康成年雌性SPF(Specific pathogen Free,SPF)级SD(Sprague Dawley)大鼠，体质量180～220 g，由广西医科大学动物实验中心提供，动物生产许可证号[SCXK桂-2014-0003]。动物均在SPF级动物标准房饲养(温湿度适中)，每笼4只大鼠，可自由饮食、自由活动，饲料饮食充足。实验经广西医科大学实验动物伦理委员会批准(伦理批准号：20171201),实验所有操作符合广西医科大学实验室及伦理相关规定。

1.1.2 主要试剂及仪器 微型血管夹、微型血管夹夹持器、有齿镊、血管钳、缝针及线等动物器械(购买于深圳市瑞沃德生命科技有限公司，商品批号：F23006-14);C6805-I型电针治疗仪(上海华谊医用仪器有限公司，商品编号：30440175332);Trizol(大连宝生物有限公司，货号9109);SYBR Green mix(南京诺维赞生物科技有限公司，货号：Q111-01);逆转录试剂盒(fermentas公司，货号K1622);SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天生物技术有限公司，货号：Q1-15201);PMSF(碧云天生物技术有限公司，货号：ST506);RIPE蛋白裂解液(索莱宝科技生物有限公司，货号：R0020);PKA抗体(美国Affiinit公司，货号：bs-0520R)。

1.2 方法

1.2.1 SCI大鼠模型的建立 造模所有实验用器械均高温消毒，准备好实验用无菌垫。将准备好的实验大鼠经10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后，俯卧位放置于手术台，术前备皮，以胸10节段为中心进行备皮碘伏消毒，逐层切开皮肤、筋膜和肌肉逐渐暴露至椎板，用平板钳慢慢咬开椎板，慢慢咬开锥弓根底部，充分暴露脊髓，用微型血管夹持器夹开微型血管夹，将血管夹打开后从脊髓下方穿过脊髓，确认穿过脊髓后，闭合血管夹20 s夹闭脊髓，造模完毕后逐层缝合组织，完成造模。术后连续3 d给予青霉素(20万单位/只/d)，术后给予膀胱按摩，助排便、排尿，避免肠梗阻与尿潴留。具体造模过程见图1。 SCI大鼠建模成功标准：①取下血管夹后脊髓被钳夹处可观察到脊髓充血；②大鼠清醒后下肢完全瘫痪，仅能靠上肢爬行。

图1 造模过程

1.2.2 大鼠分组及治疗干预 分组：根据建模成功标准选取造模成功的大鼠进行编号，并使用随机数字法分为3组：对照组、阳明胃经组和督脉组，每组20只。每组大鼠再次按照随机数字法根据治疗后留取标本时间点分为5个亚组：1周、2周、3周、4周和5周，每个亚组4只。各组于造模后3 d开始干预。干预方法：①足阳明胃经组：取“足三里”“伏兔”穴进行电针干预；②督脉组：取胸9、胸11棘突之间的督脉阿是穴位电针；③对照组：仅固定大鼠，不进行电针干预。电针干预使用0.5寸一次性无菌针灸针(0.18 mm×13 mm)针刺，进针深度约2 mm；连接电针治疗仪，以强度12～15 mV、频率2 Hz和疏密波进行电针干预。穴位选取参考《实验针灸学》[11]进行定位。

1.2.3 脊髓样本取材及保存 各组大鼠于观察时间点经水合氯醛(10%)麻醉，将其仰卧置于手术台，充分暴露心脏，用灌胃针经左心室穿刺至主动脉后用止血钳固定灌胃针，以0～4 ℃生理盐水经灌胃针灌注，剪破右心房，持续灌注直至右心房流出澄清液体、心脏及眼珠无血色。待灌注完毕后，剪取受损脊髓(以受损处为中心长约1 cm)并将样本用液氮速冻后转移至-80 ℃冰箱保存；用于免疫组化检测,大鼠经生理盐水灌注后继续用4%多聚甲醛灌注，然后取受损脊髓置4%多聚甲醛固定，备用。

1.2.4 检测 ①光学显微镜下观察PKA蛋白阳性细胞表达量：常规脱蜡脱水，烘干，4 ℃孵育过夜，隔日滴加二抗孵育20 min，DAB显色，漂洗、脱水和封片，光学显微镜下观察胞浆为棕黄色的阳性细胞表达。②(Polymerase chain reaction，PCR)：取好标本组织，充分研磨，加入1 mL trizol浸泡，离心后取上清液，加入异丙醇混合均匀沉淀20 min后以4 ℃ 12 000 r/min离心机离心，取上清液，以乙醇洗涤沉淀再次离心后取上清液，以紫外分析测定所抽提RNA的浓度。PKA上游引物：GGCTTCCAACTCCAACGAT;下游引物：TCCAACTGGGCTGTATTCT。参考引物ACTB上游引物：GCTATGTTGCCCTAGACTTCGA;下游引物：GATGCCACAGGATTCCATACC。③Western blot(WB检测)：取50～100 g组织进行充分研磨，裂解、离心和取上清后备用，SDS-PAGE胶制备、上样和电泳，封闭、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、曝光及拍照记录。

2 结果

2.1 免疫组化

从图2中可以看出，PKA蛋白阳性表达位于细胞浆和细胞膜上，1周时对照组蛋白阳性表达最强；从第2周时，阳性表达逐渐降低；至第5周时，阳性表达极低；各周间表达差异明显。整体表达督脉组和足阳明胃经组高于对照组。3周时足阳明胃经组整体表达高于督脉组，其余时间点，差异不明显。见图2。

注：1.对照组-1周；2.督脉组-1周；3.足阳明胃经组-1周；4.对照组-2周；5.督脉组-2周；6.足阳明胃经组-2周；7.对照组-3周；8.督脉组-3周；9.足阳明胃经组-3周；10.对照组-4周；11.督脉组-4周；12.足阳明胃经组-4周；13.对照组-5周；14.督脉组-5周；15.足阳明胃经组-5周。

2.2 PCR检测

PKA基因mRNA呈现先升高后降低的趋势，4周时达到最高，5周有所降低。与对照组相比，1～4周的足阳明胃经组的PKA基因mRNA表达显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，到5周时，随着脊髓损伤的逐渐恢复，虽然仍高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，督脉组PKA基因mRNA表达仅在1周时显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，其他时间点虽然也有所升高，但无统计学意义；足阳明胃经组 PKA基因mRNA在1～5周与督脉组相比，均有一定程度的升高，除3周外，其他时间点差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 PKA基因mRNA在各组大鼠表达量

2.3 WB检测

PKA蛋白在脊髓损伤修复过程中起着非常重要的作用。PKA蛋白随着时间的延长呈现先升高后降低的趋势，在2周时达到高峰，2周后表达逐渐降低。与对照组比较，1～4周足阳明胃经组的PKA蛋白表达显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，到5周时，随着脊髓损伤的逐渐恢复，虽然仍高于对照组，但差异无统计学意义。与对照组比较，督脉组PKA蛋白表达仅1～2周显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，其他时间点差异无统计学意义。与督脉组比较，足阳明胃经组PKA蛋白3周明显较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图3。

表2 各组大鼠PKA蛋白表达

注：A.对照组；B.督脉组；C.足阳明胃经组。

3 讨论

脊髓损伤发生后，机体随之出现缺血、缺氧、出血、水肿及炎症等病理变化导致内环境发生紊乱[12-14]，局部组织缺血、缺氧导致血管活性物质的释放及脊髓血液灌流的改变被视为脊髓缺血而致再灌注损伤[15-16]。脊髓损伤神经再生一直是神经研究领域重点热点难题。总体来说脊髓损伤后神经再生的困难在于：①脊髓损伤后形成一个不利于神经再生微环境[17-18]；②损伤部位存在一些抑制神经再生因子的髓鞘蛋白,如：髓磷脂相关糖蛋白(Myelin Associated Glycoprotein，MAG)、神经生长抑制因子Nogo-A和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(Oligodendrocyte Myelin glycoprotein，OMgp)，抑制轴突生长[19-20]。因此，如何构建一个良好的血氧微环境，促进神经再生因子的表达是神经研究领域重要课题。

3.1 PKA在神经轴突再生的关键作用

cAMP-PKA信号通路是目前研究比较完善的中枢神经轴突调控系统[21]，当某信号配体与细胞膜上的特异受体结合后激活腺苷酸环化酶(Adenylatecyclase，AC)，催化ATP水解成第二信使cAMP，cAMP进一步激活PKA[22-23]。激活的PKA具有灭活Rho的效应，而Rho/ROCK的活化是轴突再生抑制中重要的分子事件，可以显著降低抑制轴突再生蛋白MAG、Nogo-A及OMgp的表达水平，从而促进轴突再生[24-25]。

3.2 中医“同病异治”理论在神经再生领域的应用与现代医学内涵

脊髓损伤中医古称“体惰”，属于“痿证”范畴，中医认为：①脊髓局部受损，局部气血瘀滞，导致血气不通，阳气不达四肢,使皮肉筋脉骨节失于濡养，经气暗耗，皮肉暗萎，关节不用，故肢体萎软、麻木和活动障碍。所以针灸治疗SCI，当以“疏通督脉气血”作为治则。②《黄帝内经》提出:“治痿独取阳明”，并成为后世治痿准则，《素问·痿论》解释了其机理：足阳明胃经为五脏六腑之海，脏腑充盈，气血运行通常，则筋骨强、关节通利。所以《灵枢·根结》有云：治疗痿证，取之阳明。针刺足阳明胃经穴可补益素体阳气，增补气血之亏损，具有调理脾胃、补益气血和舒筋通络之功。针刺“督脉”“足阳明胃经”穴治疗SCI符合中医“同病异治”理论。Nogo-A/NgR信号通路与NGF/TrkA信号通路通过共同受体P75NTR蛋白结合介导胞内下游信号通路来分别发挥抑制SCI后受损脊髓局部神经可塑性的作用以促进SCI后受损脊髓局部神经可塑性[26-27]，这与中医“同病异治”理论不谋而合，本研究通过电针刺激“督脉”“足阳明胃经”探讨对SCI神经再生的恢复机制，进一步探讨中医“同病异治”的现代医学内涵。

3.3 电针刺激“足阳明胃经”“督脉”对于PKA表达水平的影响

电针是在传统中医针刺的基础上发展起来的一种现代物理疗法，通过电流波对针刺穴位进行刺激，电刺激通过胶原纤维实现信息及能量的传输，既保留了针刺作用又通过电信号传导对患者的末梢直接发挥作用而促进神经兴奋，对于神经再生具有一定的作用[28-30]。本研究结果表明电针刺激足阳明胃经及督脉穴均可以有效提高损伤部位阳性细胞的表达，提升PKA的mRNA及蛋白的表达，证明电针刺激足阳明胃经及督脉穴均可显著地提升PKA的表达，进而促进损伤神经的轴突表达；同时，由观察结果可知，足阳明胃经组PKA的表达水平要稍高于督脉的表达，在第3周电针刺激足阳明胃经的PKA表达水平显著高于督脉及对照组。其可能机制是电针通过对受损节段轴突的电刺激，使神经递质释放增加，增加轴突生长前端的Ga2+内流，从而激活第二信使钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)[31-32]，促使cAMP反应原件结合蛋白的磷酸化形成P-CREB，激活cAMP信号通路，从而参与中枢和轴突外周敏化的形成，抑制损伤后微环境中的轴突生长抑制因子表达，改善轴突生长的状态[33]。

综上所述，电针刺激足阳明胃经及督脉可以有效地促进PKA和损伤区域阳性蛋白的表达水平，进而促进受损神经轴突的再生，符合中医“同病异治”的基本理论；同时发现电针刺激足阳明胃经在某个时间点可以显著高于督脉，但其机制尚未能明确，有待于进一步的研究。