吴妙鸿,邱珊莲,林宝妹,李海明,张帅
(福建省农业科学院亚热带农业研究所,福建漳州 363005)
【研究意义】嘉宝果[Myrciaria cauliflora(DC.)Berg]是桃金娘科(Myrtaceae)拟爱神木属(Myrciaria)热带亚热带常绿小乔木或大型灌木,因其果实形状与葡萄相似,又名树葡萄、美味热带葡萄(唐丽等,2014)。嘉宝果口感独特、香味浓郁、营养丰富,且具有较高的观赏价值,在原产地巴西是最受欢迎的水果之一。已有研究表明嘉宝果中富含缩酚酸、花青素等酚类物质,具有抗氧化、抗炎、抗菌、降糖等生物活性(Wu et al.,2012;Plaza et al.,2016;Wu et al.,2016;只佳增等,2018),其在巴西民间被作为治疗痢疾的传统药物(de Albuquerque et al.,2007)。天然植物多酚因其显著的生物活性被视为对人体健康至关重要的物质,近年来,由于酚类物质的安全性和广泛性,将其开发为抗氧化剂和功能性成分已成为国内外研究热点(Wu et al.,2013)。因此,对嘉宝果叶片提取物的酚类成分和生物活性进行研究,能为相关功能性产品的开发提供参考。【前人研究进展】嘉宝果果皮、果肉和枝叶均具有一定的营养价值和健康功效(徐绍丝等,2021)。Duarte等(2010)研究表明不同土壤种植的嘉宝果叶总酚干基含量为79.69~145.04 mg/g,单宁含量为34.04~63.08 mg/g;Souza-Moreira等(2010)研究表明嘉宝果叶醇提物的总酚和黄酮含量分别达62.08%和1.25%;邱珊莲等(2018)测定分析嘉宝果根、茎、叶、果皮、果肉、种子的总酚和黄酮含量,发现其嫩叶的总酚和黄酮含量最高,生物活性最强;Ribeiro等(2019)研究发现嘉宝果叶片中含有萜类、酚类、类黄酮、单宁等物质。已有报道表明嘉宝果叶酚类成分包括鞣花酸、没食子酸、邻香豆酸、杨梅苷、槲皮黄甙等(只佳增等,2018),多种酚类物质的存在使嘉宝果叶具有较强的生物活性。邱珊莲等(2017)研究发现4个品种(沙巴、四季早生、福冈和阿根廷)嘉宝果叶醇提物均具有显著抗氧化活性。已有大量研究揭示嘉宝果叶具有抗菌活性,Mohanty和Cock(2009)研究发现嘉宝果叶提取物的抑菌率可达64%;嘉宝果叶提取物对口腔生物膜细菌具有显著的杀菌作用,是开发治疗牙科疾病药物的一个优质、经济的天然来源(Macedo-Costa et al.,2009);Oliveira等(2011)利用嘉宝果叶片提取物开发杀菌产品,发现该产品的总酚含量高,其对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和白色念珠菌(Candida albicans)均有抑菌活性。嘉宝果叶还具有降血糖活性,林宝妹等(2020b)研究发现在饲料中添加4%和8%的嘉宝果叶片对高血糖小鼠具有良好的降血糖和改善脂质代谢作用。【本研究切入点】目前,嘉宝果的主栽品种为沙巴,大红钻、保利斯塔和乔尼尔虽然不是主栽品种,但也具有一些优良的性状,如大红钻四季开花结果,成熟果实颜色鲜红、味道独特;保利斯塔果实很大、肉多汁、质量上乘,成熟期相对较晚,可抵抗锈病(张舒平和李健,2002);乔尼尔果实甜度高,有浓郁番石榴果香味,因此这3个品种嘉宝果也具有较大的经济价值和市场潜力,但目前针对这3个品种嘉宝果叶的研究尚未见报道。由于不同品种之间的酚类成分和生物活性差异较大,因此针对这几个品种的研究对其开发应用有一定意义。同时,国内外对嘉宝果叶的研究主要针对抗氧化活性和降糖活性等,关于其提取物中酚类成分的研究较少,而酚类成分是影响生物活性的关键因素,因此分析其组成十分必要。【拟解决的关键问题】以大红钻、保利斯塔和乔尼尔嘉宝果叶为试材,测定叶片提取物的总酚含量及酚类组成,研究其抗氧化活性和降糖活性,分析总酚含量与生物活性的相关性,为嘉宝果叶的开发利用提供参考依据。
大红钻、保利斯塔和乔尼尔嘉宝果叶均于2021年3月采自福建省农业科学院亚热带农业研究所闽台种质资源圃(东经117°、北纬24°),采摘质地柔软的枝条顶端嫩叶。福林酚试剂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、α-葡萄糖苷酶和胰酶购自美国Sigma公司;没食子酸、芦丁、阿卡波糖和4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)纯度均≥98%,购自日本东京化成工业株式会社;2-氯-4-硝基苯基-α-D-麦芽三糖苷(纯度95%)购自北京百灵威科技有限公司;无水乙醇、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠等均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;甲醇(HPLC级)购自德国Merck公司;没食子酸、鞣花酸、表儿茶素、儿茶素、槲皮素、杨梅苷、金丝桃苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷标准品纯度均≥98%,购自北京索莱宝科技有限公司;总抗氧化能力测定试剂盒(FRAP法)购自南京建成生物工程研究所。
主要仪器设备:GZX-9246MBE电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司);BS110S分析天平(德国Sartorius集团);PC650超声波细胞破碎仪(上海皓庄仪器有限公司);CR22N高速冷冻离心机(日本HITACHI公司);RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);FD-1冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);L5S紫外分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司);iMark酶标仪(美国Biorad公司);Waters Acqutiy UPLC H-Class超高效液相色谱、Xevo TQ-S三重四级杆质谱(美国Waters公司)。
1.2.1 嘉宝果叶提取物制备 将嘉宝果叶在60℃下烘干至恒重,粉碎后过80目筛。按1∶20(g∶mL)的比例在粉末加入70%乙醇溶液,以240 W功率超声15 min,随后以200 r/min振摇提取1 h,4000 r/min离心15 min,收集上清液,重复提取2次,合并上清液。提取液在50℃下减压旋转蒸发至无醇味,利用冷冻干燥除去剩余水分,即得嘉宝果叶片提取物冻干粉。
1.2.2 总酚和黄酮含量测定总酚含量采用福林—酚法测定(Tohidi et al.,2017)。以没食子酸为标准品,质量浓度设为0.01~0.10 mg/mL,绘制标准曲线y=10.104x+0.0251(R2=0.999),式中,x为没食子酸质量浓度(mg/mL),y为吸光值。嘉宝果叶提取物总酚含量以单位质量提取物冻干粉中所含没食子酸当 量(Gallic acid equivalent,GAE)计,单位为mg GAE/g。
黄酮含量采用硝酸铝法测定(林宝妹等,2020c)。以芦丁为标准品,质量浓度设为0.10~0.80 mg/mL,绘制标准曲线y=1.1583x+0.0029(R2=0.9997),式中,x为芦丁质量浓度(mg/mL),y为吸光值。嘉宝果叶提取物黄酮含量以单位质量提取物冻干粉中所含芦丁当量(Rutin equivalent,RE)计,单位为mg RE/g。
1.2.3 超高效液相色谱—串联质谱法(UPLC-MS/MS)分析酚类成分UPLC条件:色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱温:40℃;流动相:(A)5 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液,(B)乙腈;进样体积:4μL;流速:0.2 mL/min。梯度洗脱程序:0~5 min,90% A—10% A;5~6 min,10% A;6~8 min,10% A—50% A;8~9 min,50%A—90%A;9~10 min,90%A。
MS条件:离子源:电喷雾电离(ESI)源;离子源温度:120℃;扫描方式:多级反应监测(MRM);毛细管电压:3.0 kV(正模式)、1.5 kV(负模式);脱溶剂气温度:500℃(正模式)、450℃(负模式)。8个标准品的质谱参数见表1。
标准品溶液制备和测定:精确称取没食子酸、鞣花酸、表儿茶素、儿茶素、槲皮素、杨梅苷、金丝桃苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷标准品,用色谱纯甲醇配制成1.0 mg/mL标准品储备液。精确量取标准品储备液,用甲醇配制成系列浓度梯度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μg/mL的混合标准溶液。按照上述UPLC、MS方法及表1的质谱参数测定,以峰面积(y)对其浓度(x,μg/mL)进行线性回归,得到回归方程。8个标准品的回归方程、判定系数R2和保留时间如表1所示。
表1 标准品质谱参数和回归方程Table 1 Mass spectrometry parameters and regression equation of standard
供试样品制备:准确称取50 mg冻干粉,用甲醇定容至10 mL,配制成5 mg/mL溶液,过0.22μm有机相滤膜,取滤液待测。
1.2.4 抗氧化活性测定DPPH·、ABTS+和超氧阴离子自由基()清除能力的测定参照文献(Hu and Xu,2011;Tang et al.,2017;李国峰等,2021)的方法。自由基清除能力以清除率为50%时提取物的质量浓度(IC50)评价。
总抗氧化能力的测定采用铁离子还原/抗氧化能力法,使用总抗氧化能力测定试剂盒(FRAP法)进行测定。以单位质量样品将Fe3+还原成Fe2+的量计,单位为mmol/g。
参考Seeram等(2008)的方法,利用抗氧化能力综合指数(Antioxidant potency composite index)评价不同样品的综合抗氧化能力。首先将不同样品的4个抗氧化指标分别换算成阳性对照当量(Positive control equivalent,PCE),即单位质量样品的抗氧化能力相当于抗坏血酸的质量,将每个指标中PCE值最高的样品赋抗氧化指数为100,其他样品的抗氧化指数按下式计算:
式中,PCEsample为样品的阳性对照当量,PCEbest为样品中最高的阳性对照当量。
4个抗氧化指标的抗氧化指数平均值即为抗氧化能力综合指数。
1.2.5 降糖活性测定α-葡萄糖苷酶抑制活性测定参照李萌萌等(2017)的方法进行。
α-淀粉酶抑制活性测定参照Landa-Cansigno等(2020)的方法并做适当修改。用40 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)配制1.4 mmol/L 2-氯-4-硝基苯基-α-D-麦芽三糖苷(CNPM)和0.5 mg/mL胰酶,在96孔酶标板中分别加入60μL不同浓度的嘉宝果叶提取物溶液和120 mL CNPM,混匀后在35℃下孵育5 min;随后加入30μL胰酶,在35℃下反应10 min,立即置于酶标仪中测定其在405 nm下吸光值。磷酸盐缓冲液和阿卡波糖代替样品分别作为空白对照组和阳性对照组,磷酸盐缓冲液代替CNPM和胰酶作为样品本底组。
式中,Ac为空白对照组的吸光值,Ai为样品组或阳性对照组的吸光值,Ab为样品本底组的吸光值。
降糖活性以抑制率为50%时抑制剂的质量浓度(IC50)评价。
试验数据采用Excel 2010进行回归分析,SPSS 22.0进行显著性分析和相关分析。
由表2可知,3个品种嘉宝果叶的总酚含量存在显著差异(P<0.05,下同),在150.41~176.67 mg GAE/g,提取物冻干粉的总酚含量在458.78~535.51 mg GAE/g,以乔尼尔叶的总酚含量最高,其次是保利斯塔,大红钻最低。叶片黄酮含量在32.81~76.42 mg RE/g,提取物冻干粉的黄酮含量在99.46~233.42 mg RE/g,大红钻和保利斯塔的黄酮含量无显著差异(P>0.05,下同),以乔尼尔最低。
表2 3个品种嘉宝果叶总酚和黄酮含量Table 2 Content of total phenols and flavonoids in leaves of the 3 jaboticaba cultivars
由表3可知,不同品种嘉宝果叶提取物酚的种类相似,但含量存在明显差异。大红钻嘉宝果叶中含量较高的酚类及其排序为:没食子酸>鞣花酸>表儿茶素>儿茶素,保利斯塔的排序为:表儿茶素>儿茶素>没食子酸>鞣花酸,乔尼尔的排序为:没食子酸>鞣花酸>槲皮素-3-O-葡萄糖苷。在已检出的8种酚类物质中,没食子酸和鞣花酸为羟基苯甲酸类,儿茶素和表儿茶素为黄烷醇类,槲皮素、杨梅苷、金丝桃苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷为黄酮醇类,大红钻和乔尼尔提取物中羟基苯甲酸类占比较高,分别为62.69%和84.67%,保利斯塔则是黄烷醇类占比最高,为58.85%。
表3 嘉宝果叶提取物酚类成分含量比较(mg/g)Table 3 Comparison of phenolic components in extracts from jaboticaba leaves(mg/g)
3个品种嘉宝果叶提取物的抗氧化活性见表4。在一定浓度范围内,DPPH·清除能力与提取物的质量浓度呈线性关系。不同品种间的清除能力有显著差异,乔尼尔的清除能力最强,其次是保利斯塔,大红钻最弱,其IC50分别为8.48、8.83和9.73μg/mL,三者的清除能力均低于抗坏血酸;抗坏血酸的PCE值最高,将其DPPH·清除能力赋值为100,则乔尼尔、保利斯塔和大红钻的清除能力指数分别为93.0、89.4和81.1。
嘉宝果叶片提取物的ABTS+清除能力与质量浓度在一定范围内呈线性关系。不同品种间的清除能力有显著差异,乔尼尔的清除能力最强,其次是保利斯塔,大红钻最弱,其IC50分别为77.02、80.79和85.70 μg/mL,乔尼尔的清除能力与抗坏血酸无显著差异,保利斯塔和大红钻则显著低于抗坏血酸;抗坏血酸的PCE值最高,将其ABTS+清除能力赋值为100,则乔尼尔、保利斯塔和大红钻的清除能力指数分别为96.8、92.3和87.0。
嘉宝果叶片提取物的总抗氧化能力代表其还原Fe3+的能力,乔尼尔的总抗氧化能力最强,为0.922 mmol/g,大红钻与保利斯塔无显著差异,总抗氧化能力分别为0.706和0.698 mmol/g,但三者的总抗氧化能力均低于抗坏血酸。把抗坏血酸的抗氧化指数定义为100,则乔尼尔、大红钻和保利斯塔的抗氧化指数分别为76.7、58.7和58.1。利用4个抗氧化指标对应的指数,分别计算每个样品的抗氧化能力综合指数,以综合评价其抗氧化能力强弱。由表4可知,抗氧化能力综合指数最高的是乔尼尔叶提取物,其次是保利斯塔,最低的是大红钻,说明乔尼尔的综合抗氧化能力最强。
表4 嘉宝果叶提取物抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of extracts from jaboticaba leaves
3个品种嘉宝果叶提取物的降糖活性见表5。在一定浓度范围内,α-葡萄糖苷酶抑制率与提取物质量浓度呈对数函数关系,保利斯塔的抑制活性最强,其IC50为14.96μg/mL,大红钻与乔尼尔间无显著差异,IC50分别为28.11和28.73μg/mL,三者的抑制活性均显著高于阳性对照阿卡波糖(IC50为2958 μg/mL)。α-淀粉酶抑制率与提取物质量浓度呈对数函数关系,3个品种叶片提取物的α-淀粉酶抑制活性存在显著差异,保利斯塔最强,其次是大红钻,乔尼尔最弱,其IC50分别为57.42、153.59和205.73μg/mL,阿卡波糖的α-淀粉酶抑制活性则显著高于嘉宝果叶片提取物。
表5 嘉宝果叶提取物降糖活性Table 5 Hypoglycemic activity of extracts from jaboticaba leaves
嘉宝果叶提取物总酚含量与抗氧化活性、降糖活性的相关性见表6。总酚含量与DPPH·、ABTS+和清除能力均呈极显著正相关(0.870≤r≤0.999,P≤0.002),与总抗氧化能力呈显著正相关(r=0.712,P=0.031),与α-葡萄糖苷酶抑制活性和α-淀粉酶抑制活性相关性不显著。
表6 总酚含量与生物活性的相关性Table 6 Correlations between content of total phenols and biological activity
本研究测得大红钻、保利斯塔和乔尼尔嘉宝果叶总酚含量为150.41~176.67 mg GAE/g,黄酮含量为32.81~76.42 mg RE/g,林宝妹等(2018)利用70%乙醇提取沙巴、四季早生、福冈和阿根廷4个品种嘉宝果嫩叶的总酚,发现其总酚含量为123.27~273.70 mg/g,本研究的3个品种总酚含量均大于福冈,小于沙巴、四季早生和阿根廷。3个品种嘉宝果叶提取物的总酚和黄酮含量分别为458.78~535.51 mg GAE/g和99.46~233.42 mg RE/g,黄艳等(2017)对同为桃金娘科且具有药用价值的番石榴叶正丁醇提取物的总酚和黄酮含量进行测定,发现含量分别为215.55和17.88 mg/g,均明显低于本研究的嘉宝果叶提取物,说明嘉宝果叶片在提取酚类、黄酮等活性物质方面具有较大优势,利用嘉宝果叶提取物开发健康产品有巨大潜力。
本研究测得大红钻和保利斯塔叶片提取物中含量较多的酚类物质为没食子酸、鞣花酸、儿茶素和表儿茶素,乔尼尔则为没食子酸、鞣花酸和槲皮素-3-O-葡萄糖苷;Neves等(2021)利用高效液相色谱—二极管阵列检测器—电喷雾质谱联用法(HPLCDAD-ESI/MS)分析5个品种嘉宝果果皮、果肉和种子的酚类成分,结果表明不同品种间存在显著差异,嘉宝果果皮中存在大量槲皮素、杨梅素和鞣花酸的衍生物,果肉和种子存在大量的鞣花单宁类物质、没食子酸和鞣花酸,同时存在少量的儿茶素和没食子儿茶素,本研究3个品种嘉宝果叶提取物中酚的种类与Neves等(2021)的研究结果相似,但含量占比存在差异,这是由于不同部位的酚类组成有所差异。林宝妹等(2021)利用HPLC法分析沙巴嘉宝果叶提取物的酚类成分,发现鞣花酸、杨梅苷和金丝桃苷的含量分别为11.44、10.28和3.02 mg/g,高于本研究3个品种的含量,可能是品种之间的差异导致。本研究测得嘉宝果叶提取物中8种酚类成分的总含量低于总酚含量,一方面是由于福林—酚法测得总酚含量是以没食子酸当量计算,与实际的酚类质量存在差异;另一方面,根据前人报道(只佳增等,2018;Ribeiro et al.,2019;林宝妹等,2021),除上述8种酚类外,嘉宝果叶中还存在邻香豆酸、槲皮黄甙、芦丁、单宁及其他尚未被发现的酚类组分,因此下一步工作将继续对嘉宝果叶酚类组分进行测定研究,以期较全面地了解其酚类组成。
本研究利用抗氧化能力综合指数分析3个品种嘉宝果叶提取物的抗氧化活性,发现乔尼尔的抗氧化活性最强,其次是保利斯塔,最弱的是大红钻,三者的抗氧化能力综合指数分别为68.00、61.44和57.66,对比提取物的总酚含量发现,总酚含量越高的品种抗氧化能力综合指数越强。Souza-Moreira等(2010)的研究结果也表明嘉宝果叶具有显著的抗氧化活性,且活性大小与总酚含量相关,本研究结果与其结果一致,说明酚类成分可能是抗氧化活性的主要贡献物质。本研究中,3个品种嘉宝果叶提取物清除DPPH·和ABTS+的IC50分别为8.48~9.73μg/mL和77.02~85.70μg/mL,林宝妹等(2021)测得沙巴嘉宝果叶片提取物清除上述2种自由基的IC50分别为7.52和60.12μg/mL,可见在清除DPPH·和ABTS+能力上,沙巴略强于本研究的3个品种。与被认为可作为天然抗氧化剂应用于食品或保健品中的金花茶叶相比,金花茶叶提取物清除DPPH·和ABTS+的IC50分别为121和655μg/mL,FRAP为0.822 mmol/L(张武君等,2020),抗氧化能力弱于嘉宝果叶片。
淀粉是人体摄入最多的碳水化合物之一,α-淀粉酶可将淀粉水解为寡聚糖,再由α-葡萄糖苷酶水解释放葡萄糖,葡萄糖由肠道吸收后提高血糖浓度,因此抑制上述2种酶的活性能有效抑制餐后血糖水平升高(Goodman,2010;李美华等,2018)。本研究中,3个品种嘉宝果叶提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均具有抑制作用,IC50分别为14.96~28.73μg/mL和57.42~205.73μg/mL,保利斯塔的抑制作用强于其他2个品种。林宝妹等(2019)研究发现沙巴嘉宝果嫩叶醇提物对α-葡萄糖苷酶的IC50为3.10μg/mL,活性高于本研究3个品种。嘉宝果叶片提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性明显高于目前作为降低餐后血糖药物的阿卡波糖,说明其降糖作用显著,是开发降糖产品的优质天然来源。3个品种嘉宝果叶提取物的α-淀粉酶抑制活性均低于阿卡波糖,能避免由于过度抑制α-淀粉酶导致大量未被酶解的淀粉在肠道中发酵产气,引起胃肠道不良反应(林宝妹等,2020a)。
相关分析结果表明,嘉宝果叶提取物总酚含量与DPPH·、ABTS+和清除能力呈极显著正相关,与总抗氧化能力呈显著正相关,与邱珊莲等(2017)研究发现4个品种(沙巴、四季早生、福冈和阿根廷)嘉宝果叶片醇提物总酚含量与清除DPPH·、ABTS+能力均呈极显著正相关的结果一致。有大量研究已表明总酚含量与抗氧化活性具有明显的量效关系,曹双(2015)利用5个抗氧化能力评价指标分析番石榴抗氧化能力,发现其与酚类、黄酮含量具有显著相关性;陈青青等(2020)发现覆盆子叶总酚对抗氧化活性贡献程度最高;马飞跃等(2021)研究发现桑葚叶总酚含量与其提取物抗氧化能力呈正相关。有报道表明,植物多酚清除自由基能力和抗氧化能力与邻苯二酚或邻苯三酚等酚羟基结构相关,因为邻位酚羟基不仅可被氧化成醌类结构,还具有很强的捕捉活性氧等自由基的能力(吴建华等,2015)。本研究中,嘉宝果叶提取物总酚含量与α-葡萄糖苷酶抑制活性、α-淀粉酶抑制活性相关性均不显著,与洪佳敏等(2019)的研究结果一致,由此可知,嘉宝果叶的降糖活性并非主要由酚类发挥作用。Ribeiro等(2019)研究发现嘉宝果叶提取物中除酚类外还存在熊果酸(五环三萜类物质)、萜类和皂苷,已有大量报道表明萜类和皂苷均具有显著降血糖活性(张玉朝,2020;金斐等,2021),因此这2类物质极有可能是抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的主要有效成分。上述研究结果表明,嘉宝果叶酚类物质是抗氧化活性的主要贡献物质,而对于降糖活性的贡献较小。
大红钻、保利斯塔和乔尼尔嘉宝果叶提取物均含有没食子酸、鞣花酸、表儿茶素、儿茶素、槲皮素、杨梅苷、金丝桃苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷等酚类成分。乔尼尔的总酚含量最高,抗氧化活性最强,保利斯塔的降糖活性最强。总酚含量与抗氧化活性呈显著正相关,与降糖活性相关性不显著。3个品种嘉宝果叶提取物是开发抗氧化和降血糖健康产品的良好来源,可用于开发抗氧化护肤产品和系列养生食品。