食源性蛋白质淀粉样纤维的研究进展

张丽娜，殷静霖，熊舟翼，熊汉国*

(1.华中农业大学 食品科学与技术学院，武汉 430070；2.武汉农业科学技术研究院农产品加工中心，武汉 430200)

近年来，基于自组装技术构建纳米或微米等不同尺寸的淀粉样纤维结构，利用其优良的功能特性制备绿色安全的乳化剂，并应用于稳定食品体系和作为生物活性物质的输送载体成为研究热点[1]。20世纪80年代，Drexler提出自组装技术可以通过蛋白质作为基本构建单元共价交联形成高度有序的超分子结构[2]。食源性蛋白质不仅是满足人类营养需要的重要蛋白质资源，而且具有生物安全性、生物相容性和生物降解性等优点，是构建输送活性物质载体的优良来源。食源性蛋白质在特定环境下利用蛋白质分子间的相互作用组装淀粉样纤维，不同的食源性蛋白质可能会形成不同的结构，从而在宏观层面上获得食品的不同功能，这一现象在食品加工方面具有巨大潜力[3]。本文主要阐述了几种常见的自组装食源性蛋白质以及其自组装纤维的形成机制、影响因素和纤维自组装过程的表征手段，以期为新型纳米材料在食品工业和材料科学中的具体应用提供理论支持。

1 淀粉样纤维形成机制

自组装是指基本构建单元自发形成有序的且具备功能特性的超分子结构的过程。在食品体系中，蛋白质达到一定的临界浓度是自组装过程发生的前提条件；其次，热处理的温度必须高于蛋白质的变性温度，满足这两个条件才可以形成淀粉样纤维[4]。一般情况下，蛋白质自组装在强酸环境中进行，当pH远离蛋白质的等电点时，蛋白质之间的静电排斥作用会增大，同时热处理使蛋白变性，暴露出内部疏水基团，增强了蛋白分子间的疏水相互作用，溶解状态下的天然球蛋白单体在疏水相互作用和静电相互作用等驱动力的作用下有序聚集，形成具有一定长度的蛋白纤维。

对于球状蛋白质形成淀粉样纤维聚合物的过程，Nelson等[5]将淀粉样纤维的模型分为以下三类：第一类是天然蛋白质全部(或部分)展开，随后重新折叠形成纤维，蛋白组成影响纤维化的速度和稳定性；第二类是天然无序蛋白质结构化，形成含有β-折叠结构的淀粉样纤维；第三类是天然蛋白质空间构象改变，暴露出隐藏部位，与其他分子结合形成纤维。多数学者对蛋白质自组装行为相对认可的行为机制是“成核-聚集”动力学模型，淀粉样原纤维形成动力学见图1，其通常具有S型生长曲线的特征，蛋白质的自组装纤维化需要一定的滞后期，迟滞期可以视为晶核的形成期，通常持续数小时甚至数天，对应图中A；晶核一旦形成，连接位点增多，如果体系中构建单元足够多，那么自组装反应进程会加速，对应图中B，当基本构建单元耗尽或系统达到平衡时，最终达到平衡期C，加入预制的晶核可以消除滞后阶段，加速蛋白质的纤维化进程，这表明其在成核过程中起到关键作用[6]。

图1 自组装纤维形成的成核-聚集动力学

2 淀粉样纤维影响因素

球蛋白自组装可以通过改变体系pH、盐离子浓度、加热温度以及蛋白质浓度等环境条件控制自组装聚集体的类型和大小，产生4种类型的聚集体：半柔顺型纤维(淀粉样纤维)、柔性线型纤维、致密球型和分型聚集体[7]。蛋白的自组装行为赋予其新的功能特性，从而使蛋白纤维可以作为增稠剂、乳化剂、起泡剂和纳米凝胶递送体系的构建材料。

2.1 离子强度

离子强度影响溶液体系中粒子的静电作用强度，离子强度越低，蛋白自组装的速率越慢，离子强度越高，产生静电屏蔽效应，减弱构建单元之间的静电斥力，使其发生聚集。在低pH值和低盐浓度体系下，卵白蛋白自组装生成富含β-折叠结构的长度约3 μm、具有较好刚性结构和淀粉样特征的长半柔性纤维[8]。Veerman等[9]用透射电子显微镜研究了离子强度(0.01～0.035 mmol/L)对卵白蛋白纤维轮廓长度的影响，在测量的离子强度范围内，观察到长度大致相等的纤维(±200 nm)，而且透射电镜照片显示，稀释后纤维的轮廓长度随时间延长保持不变，表明蛋白的自组装是不可逆的。Weijers等[10]认为溶液处于低离子强度时，静电斥力会抑制卵白蛋白的无规则聚集，自组装成高度有序的线性纤维，而增加盐离子的浓度，体系的静电斥力减弱，分子间相互作用力诱导卵白蛋白的纤维形态从线型向簇状聚集体转变。

2.2 蛋白质浓度

蛋白质浓度也是影响淀粉样纤维聚合的重要因素之一。通常来说，当蛋白质浓度低于临界浓度时，还不能够达到形成淀粉样纤维的要求，较高的蛋白浓度会增加构建单元分子共价交联的机会，有利于聚集体的形成，然而浓度太高会导致粒子间的“拥挤效应”而不利于纤维聚集体形成，甚至超过溶解度而形成沉淀。Amaudov等[11]研究了β-乳球蛋白在pH 2.0下热诱导纤维聚集形成动力学，利用核磁共振和原子力显微镜分析β-乳球蛋白形成的淀粉样纤维聚合物的最低质量浓度分别为2.5%和1%，低于关键蛋白浓度，不足以形成淀粉样纤维。Kroes-Nijboer等[12]使用硫黄素T法测定了β-乳球蛋白在pH为2.0时形成纤维的临界聚集浓度，实验结果表明，在实验误差范围内，β-LG纤维的形成与温度无关，在pH为2的温度范围内，纤维的形成是一个熵驱动的过程，纤维聚集速度随β-乳球蛋白浓度的升高而加快。此外，Veerman等研究表明增加卵白蛋白浓度时，自组装纤维的长度也随之增加，且形成的自组装纤维性质更趋于稳定。

2.3 pH值

pH值不仅影响淀粉样纤维形成的动力学，也影响其形态学。大量研究表明，当溶液pH值远离蛋白质的等电点(pI)时，由于蛋白质分子表面带有大量的正电荷，而这种电荷不能被有效屏蔽，蛋白质分子易自组装形成高度有序的线性纤维聚集体[13]；而当蛋白质溶液的pH值接近蛋白质的等电点(pI)时，球状蛋白构象发生改变，在疏水相互作用为主导作用力下可快速随机聚集，形成球形聚集体[14]。刘佩等[15]研究了在pH 2.0和pH 7.0条件下制备乳清蛋白纤维状聚集体和球状聚集体两种不同形态的蛋白质聚集体，发现在不同pH或盐离子浓度环境下两种聚集体的乳化性能均有提高。Zou等[16]研究了在pH 2.0，85 ℃条件下对葡聚糖-β-大豆球蛋白自组装成纳米纤维的影响，以及纳米纤维在pH 2.0～10.0下的稳定性，研究表明在中性pH条件下，共轭纳米纤维具有高度的分散性和透明性，并且与混合物相比保持了更好的结构稳定性。共轭纳米纤维稳定性的提高可能是由于糖基化提供了一定的空间位阻，阻止了纳米纤维的聚集，这也有利于β-大豆球蛋白纳米纤维在食品工业中的应用。

图2 β-乳球蛋白形成的颗粒和淀粉样纤维的ESEM和TEM显微图

2.4 蛋白种类

蛋白种类会影响自组装纤维化进程。不同种类的蛋白，氨基酸组成不同，在热处理过程中蛋白质极性和非极性氨基酸定向排列，水解后易成为构建单元，通过分子相互作用形成淀粉样纤维。卵白蛋白在高温、低pH下可以形成长半柔性纤维聚集体；而在蛋清蛋白中，卵转铁蛋白可以抑制卵白蛋白淀粉样纤维状结构的形成，导致卵白蛋白在组装过程中蛋白分子相互聚集，形成短且具有分支结构的可溶性聚集体[17]。刘晶[18]在85 ℃，pH 2.0条件下制备不同热处理时间的芸豆蛋白、绿豆蛋白和红豆蛋白纤维体，利用原子力显微镜发现，芸豆蛋白不仅快于红豆蛋白形成纤维前体，而且形成了半柔顺性的长线性纤维，而绿豆蛋白则形成短棒状纤维。Yu等[19]将卵白蛋白和带相反电荷的溶菌酶通过自组装形成具有球型壳-核结构的纳米凝胶，纳米凝胶的核主要由带正电荷的溶菌酶组成，而壳主要由带负电荷的卵白蛋白组成。凝胶表面卵白蛋白分子间的静电斥力使纳米凝胶可以在水溶液中保持稳定。

2.5 温度

温度是影响淀粉样纤维聚合物形成的一个重要因素。热处理温度必须大于蛋白质的变性温度才可能发生蛋白纤维化，如果加热温度过低，加热再长时间都不会形成纳米纤维。蛋白质由于高温处理而发生变性，其天然的紧密三级结构遭到破坏，蛋白构象发生改变，使蛋白内部的疏水性氨基酸暴露于分子表面，蛋白分子间疏水相互作用增强，形成聚集体[20]。Loveday等[21]在同样条件下研究β-乳球蛋白在不同加热温度下的自组装动力学，发现不同温度下均有自组装现象产生，与在80 ℃下加热相比，在100 ℃下加热始终具有较高的黏度，在120 ℃下加热2 h以上降低了黏度，说明温度过高会使原纤维断裂。刘炜熹等[22]研究在20～30 ℃温度范围内，升温加快了乌鳢鱼皮胶原蛋白肽自组装速率，形成的三维网络致密性增强，提高了聚集体的稳定性。同时，加热时间也对淀粉样纤维形成动力学有一定的影响，Wang等[23]研究水解加热(pH 2.0，85 ℃，0～24 h)和培养时间(0～7 d)对大豆分离蛋白(SPI)淀粉样纤维形成的影响，在原子力显微镜下观察到，85 ℃水解8～10 h，室温孵育3 d，可形成稳定的淀粉样蛋白纤维，纤维中含有的规则二级结构明显多于大豆分离蛋白，且蛋白质溶解度随着水解时间的延长(0～24 h)而增加。

3 淀粉样纤维形成方式

3.1 蛋白质-蛋白质自组装

许多蛋白质都可以形成淀粉样原纤维，包括一些与淀粉样变性无关的蛋白质，这使得人们认为淀粉样蛋白的形成是多肽链的一种通用属性[24]。常见的食源性自组装蛋白有β-乳球蛋白、大豆蛋白、醇溶蛋白、乳清蛋白等。研究者发现在pH 5.0～6.0的范围内，由于蛋白表面净电荷趋近零，卵白蛋白和卵转铁蛋白的自组装纳米凝胶会发生二次聚集。而通过葡聚糖修饰卵白蛋白并进一步与卵转铁蛋白自组装，形成具有核壳结构的纳米凝胶[25]。Akkermans等[26]通过酸热诱导乳清分离蛋白(WPI)，形成的自组装纤维的胶体溶液具有较高的黏度和剪切变稀行为，且添加自组装纤维可以增加WPI溶液的黏弹特性和凝胶性。除此之外，蛋白质可与其他蛋白之间发生自组装反应。付思晗等[27]利用反溶剂共沉淀法制备玉米醇溶蛋白/乳清蛋白纤维核复合纳米粒，结果表明复合纳米粒乳化性明显提升，并为制备Pickering样稳定剂提供了一种新方法。

3.2 蛋白质-糖类自组装

结合大分子在拥挤环境下的美拉德反应和自组装两步法实现了球状蛋白和葡聚糖复合物的组装，蛋白质在加热条件下变性，在疏水相互作用力主导下并伴随静电斥力作用形成淀粉样纤维。蛋白质和葡聚糖的共价结合可以改变蛋白质的空间结构，增大了空间位阻，可以有效抑制蛋白质聚集，从而赋予其更高的稳定性[28]。Liu等[29]在pH 2.0，90 ℃加热条件下制备了葡萄糖、乳糖或麦芽糊精糖化的乳清分离蛋白纳米纤维，研究表明，基于糖化蛋白的纳米纤维具有独特的特性，可用于制备具有可控消化和释放特性的乳剂。冯纪璐等[30]利用大豆多糖修饰大豆分离蛋白，形成两亲性聚合物，并通过静电引力及疏水相互作用诱导该聚合物自组装，形成球状的纳米凝胶。研究表明疏水基团暴露使纳米凝胶内部形成疏水微区，有利于荷载疏水性药物，在食品加工中具有广阔的应用前景。

3.3 蛋白质-无机纳米自组装

近年来，由于蛋白质-无机纳米组装构建的复合纳米材料不仅能保持原蛋白的生物学功能和无机纳米材料在光学、电磁学、热学中特殊的物理性能，而且相互作用赋予了复合纳米材料新的功能，其在生命科学、生物医学领域中占据越来越重要的地位。复合纳米中常见的蛋白包括胶原蛋白、乳铁蛋白、酪蛋白等[31]。Freitas等[32]构建了阳离子聚(DL-丙交酯-乙交酯共聚物)-聚乙烯亚胺(PLGA-PEI)纳米颗粒和阴离子醇溶蛋白-透明质酸(HA)多粒子纳米凝胶，通过静电吸引组装成大尺寸的3D结构胶体凝胶，其具备高稳定性、可塑性强、可注入性的优点，且胶体凝胶对槲皮素类化合物具有很高的负载效率，并表现出显著的抗炎活性。王捷[33]利用蚕丝蛋白分别调控金纳米粒子和二氧化硅纳米粒子作为抗肿瘤药物载体，通过动物实验发现，复合纳米粒子能够有效抑制肿瘤细胞的生长，对肿瘤等重大疾病的临床治疗有重大意义。

4 表征手段

4.1 硫黄素T荧光

淀粉样纤维可以利用硫黄素T测定，这是一种广泛用于淀粉样蛋白形成过程的诊断试验。硫黄素 T 是一种阳离子苯并噻唑荧光染料，通过与淀粉样纤维的β-折叠结构特异性结合，荧光强度发生变化，可对淀粉样纤维进行生长检测[34]。荧光标记物在440 nm的激发波长下能产生特征荧光发射峰，淀粉样纤维的β-折叠结构数量越多，发射峰的峰值越高，荧光强度越强，荧光强度的增强表明蛋白质构象在组装过程中发生变化，分子内部交联形成高度有序的纤维化结构。殷静霖等[35]研究了不同时间的热处理对卵白蛋白自组装的形成机制，利用ThT染料测量OVA纤维的荧光强度，在淀粉样纤维形成过程中没有出现明显的滞后，并在12 h达到了最大的荧光强度，作为乳液稳定剂具有一定的应用价值。

4.2 原子力显微镜

纳米纤维的微观形貌观察对淀粉样纤维的生长动力学研究具有重要的意义。原子力显微镜(AFM)通过检测样品表面和微型力敏感探针之间的极微弱相互作用力获取样品的表面结构及性质信息。与透射电子显微镜(TEM)不同的是，AFM可以提供样品的三维表面图，且不需要对待测样品进行特殊处理，避免不可逆转的伤害，利用AFM可以在分子水平上检测淀粉样纤维纳米的微观结构，能够提供蛋白质纤维化聚集体的形态动力学和结构特征。与原子力显微镜相比，透射电子显微镜更直观，可以得到同一个待测样品中较好的代表样品高度与特征形貌等的图片，监测淀粉样纤维不同时期的转化过程[36]。徐红华等[37]利用TEM观察酪蛋白混入的时间对乳清浓缩蛋白(WPC)形成纳米纤维的影响，在稳定期混入酪蛋白对WPC纤维微观结构的形成影响不大，在成核期和生长期混入酪蛋白会破坏WPC纤维的结构。Li等[38]利用AFM观察了3种豆科植物蛋白淀粉样纤维形成行为，分析结果表明碗豆球蛋白组分更有利于纤维的形成，富含碗豆球蛋白的COP纤维中有较长的柔韧纤维，而LP和CHP纤维中分别有半弹性纤维和刚性纤维。

4.3 动态光散射法

动态光散射法(DLS)是表征溶液中蛋白质平均粒径尺寸及平均分布的技术手段，具有灵敏、精准、可重复性等优点。由于样品溶液颗粒的布朗运动，散射光光强随着时间的变化而波动，通过Stokes-Einstein方程可以获取颗粒粒度信息。PDI通常用来评价样品溶液的平均均匀性，PDI值越大，样品溶液的粒径分布范围越大；PDI值越小，样品溶液的粒径分布范围越小。具有较小粒径值和较低PDI的淀粉样纤维是自稳定的。因此，可以根据动态光散射法测量溶液中平均粒径分布变化和PDI值表征淀粉样蛋白形成过程和分布状态[39]。Li等利用DLS对3种豆科植物蛋白的组装行为进行了监测，豆类蛋白质在加热初期部分变性，相应的豆类蛋白质的粒径首先减小，这可能是热处理和酸水解导致多肽降解和结构破坏，由于有序结构的重组，蛋白质的粒径随加热时间的延长而增大。Bolisetty等[40]利用DLS研究了β-乳球蛋白在pH 2，90 ℃条件下形成的淀粉样纤维结构随时间变化的演化，结合SANS、DLS和AFM手段分辨和识别纤维形成过程的不同阶段，包括原丝的形成、原丝排列和聚集成成熟的多股原纤维，以及沿其轮廓长度的周期性间距的发展。

4.4 圆二色谱法

圆二色谱法(CD) 能够根据一系列光谱区域内蛋白质的结构信息，结合杨氏方程计算蛋白二级结构含量。淀粉样纤维的形成通常伴随着β-折叠结构含量的增加，所以CD光谱是研究淀粉样纤维形成的一种有效手段。Mantovani等[41]用CD研究了在pH为2和7时，机械加工对非加热乳清蛋白和乳清蛋白原纤维二级结构的影响。将乳清蛋白纤维体系的pH值从2提高到7后，观察到较低的椭圆度，最小椭圆度和过零点进一步向更低的波长移动，表明蛋白质二级结构含量的损失大。Hu等[42]通过热诱导自组装制备了酰化卵清蛋白(AOVA)纳米凝胶，并用CD光谱测定了NOVA、AOVA的二级结构，与NOVA相比，AOVA的α-螺旋几乎没有变化，β-折叠急剧减少7.1%，表明AOVA比NOVA更具柔韧性和无序性，可能是因为琥珀酰基的引入增强了分子间的静电斥力和空间位阻，导致卵白蛋白去折叠，构象灵活性增加，为食品加工应用提供了一种新型的食品级姜黄素包埋系统。

5 展望

蛋白质纤维化技术是一种在食品科学中很有前景的改善天然蛋白质功能特性的技术，通过有目的地控制蛋白自组装的条件诱导形成蛋白纤维，获得优良的功能性质，从而使蛋白纤维可以作为增稠剂、乳化剂、起泡剂和纳米凝胶递送体系的构建材料。目前，针对淀粉样纤维的研究主要围绕环境条件对其纤维聚集组成和形态的影响，以及纤维结构的表征，对于稳定复杂的多相食品体系还有待进一步研究。发展利用胶体、界面化学手段构建基于食品蛋白自组装纤维的活性物质胶体递送体系的研究有重要的应用价值，并可以促进蛋白凝胶型乳液在食品工业中的应用与发展。