八角茴香三萜类化合物分离及其生物活性研究

孔馨逸，江大海，王洁

(1.西京学院 医学院，西安 710123；2.陕西步长高新制药有限公司，西安 710119；3.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000)

八角茴香是八角属植物的果实，又被称为八角、大料和大茴香[1]。其干燥成熟的果实中主要含有芳香油、脂肪油、蛋白质和树脂等[2]，是我国具有特色的香辛料，它具有健胃止呕、祛痰镇痛的功效，主要分布在我国的云南、贵州、广西等地。八角茴香是较好的天然香料和调味品，在中国、印度等国家被广泛地用于去除食品中的腥味[3]。

八角茴香作为食品，能直接用于调味或当作香料加入食品中。品质较好的八角茴香中具有特殊的香气和甜味，用途广泛，使用方便。八角茴香精油也具有抑菌作用，能够作为食品防腐剂被使用，具有无副作用且能保持天然食品风味的优点。八角茴香中具有多种生物活性成分，主要包括茴香酮、茴香醛和茴香三萜，这些活性成分具有多种生物活性物质的特点[4]。

近些年的研究结果表明，一些小分子中的萜类也具有明显的生物活性功能[5]。自然状态下的萜类物质难溶于水，易溶于极性较低的有机溶剂，例如甲醇和乙醇。目前，常见的提取三萜类化合物的方法有溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和超临界二氧化碳萃取法[6]。溶剂提取法提取效率低，需要的溶剂量大，但操作简单、成本低[7]；超声波辅助提取法具有效率高、耗时短、所需溶剂少等优点；微波辅助提取法具有穿透力强、加热快、加热均匀、节能等优点[8]；超临界二氧化碳萃取法具有无毒、操作流程简单、效率高、能最大限度地保护生物活性物质等优点[9]。

三萜类物质具有多种生物活性和药理功效，特别是在抗肿瘤、抗病毒、保肝、抗炎、调节机体免疫力等方面具有药用功效[10]。大量的试验和研究结果表明，许多三萜类化合物能明显地抑制肿瘤细胞的增长[11]。

目前，国内八角茴香中三萜类物质的提取和抗肿瘤活性的研究报道相对较少。所以，本研究通过采用超声波辅助法对八角茴香中的三萜类物质提取工艺进行优化，并对体外的抗肿瘤活性的分子机制进行研究，旨在为八角茴香中三萜类成分的利用和综合开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验试剂与仪器

八角茴香：采集于云南普洱哀牢山，用粉碎机粉碎，待用。

植物粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；电子天平 上海精密科学仪器有限公司；蒸发器 上海申生科技有限公司；恒温箱 上海跃进医疗器械有限公司；干燥箱 上海一恒科技有限公司；分光光度计 上海光谱仪器有限公司；超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；细胞仪 Beckman Coulter公司。

1.2 试验方法

1.2.1 八角茴香三萜提取工艺流程

称取八角茴香粉末于提取器皿中，加入适量的乙醇溶液，在一定的浓度、温度和固液比例条件下提取一定时间，冷却、过滤、压缩干燥后获得八角茴香三萜[12]。

八角茴香→超声波辅助提取→过滤→减压浓缩→真空干燥→八角茴香三萜乙醇提取物。

1.2.2 八角茴香三萜浓度的测定

准确称取八角茴香粉末1 g于试管中，加入0.1 mL的乙醇溶液，塞上试管塞，在70 ℃的条件下水浴，待溶剂挥发，加入0.2 mL 5%的香草醛溶液，摇匀，再加入0.8 mL的高氯酸充分地摇匀，在70 ℃的条件下水浴20 min后迅速冷却至室温，使用乙酸乙酯定容至5 mL，摇匀，在波长551 nm处测定吸光值[13]。

1.2.3 超声辅助法提取八角茴香三萜工艺优化

1.2.3.1 单因素试验分析

称取干八角茴香粉1 g，控制乙醇浓度70%、超声时间60 min、超声温度40 ℃和液固比例20∶1。改变其中1个参数，保持其他3个参数不变，分别改变乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%，超声时间为20，30，40，50，60 min，超声温度为50，55，60，65，70 ℃，液固比例为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1。

1.2.3.2 正交试验分析

根据单因素试验结果，对影响较为显著的3个因素(乙醇浓度、超声时间和超声温度)进行优化，获取八角茴香三萜提取的最佳工艺参数，见表1。

表1 八角茴香三萜类化合物提取正交试验

1.2.4 八角茴香三萜对癌细胞的抑制作用研究

1.2.4.1 MTT法检测细胞增殖

MTT溶液的配制(5 mg/mL)：称取MTT 0.5 g，溶解于100 mL的D-Hanks溶液中，通过0.22 μm的滤膜进行过滤除菌，将其放于4 ℃的冰箱中保存待用[14]。

1.2.4.2 MTT检测方法

将对数期的细胞以每个孔5000个细胞的密度接种于96孔板上，放置在37 ℃的恒温室中进行培养，控制空气中的二氧化碳浓度为5%，培养12 h；添加不同浓度的八角茴香三萜；细胞处理的时间到达后，再添加20 μL的MTT溶液，继续培养4 h；除去上清液，继续振荡培养10 min；在波长490 nm处测定其吸光值。

2 结果与分析

2.1 超声辅助法提取八角茴香中三萜工艺研究

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 乙醇浓度对八角茴香三萜得率的影响

由图1可知，八角茴香中三萜得率随着乙醇浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，当乙醇浓度达到70%时，八角茴香中三萜得率最高，为8.1 mg/g。当乙醇浓度为50%～70%时，八角茴香中三萜得率随着乙醇浓度的增加而升高；当乙醇浓度大于70%时，八角茴香中三萜得率随着乙醇浓度的增加而降低。这是由于乙醇浓度过低，溶液中的水溶性物质较多，影响了八角茴香中三萜得率。而当乙醇浓度过高时，三萜类物质中的极性基团、羟基和羧基与乙醇溶液呈现一定的极性[15-16]。所以，乙醇浓度过高或者过低均会影响八角茴香中乙醇的提取。综上，当八角茴香提取的乙醇浓度为70%时，三萜提取效果最好。

图1 乙醇浓度对八角茴香三萜得率的影响

2.1.1.2 超声温度对八角茴香三萜得率的影响

由图2可知，随着超声温度的升高，八角茴香中三萜得率呈现先升高后降低的趋势，当超声温度为60 ℃时，八角茴香三萜的得率最高，为9.0 mg/g；当超声温度为60～70 ℃时，八角茴香中的三萜物质随着超声温度的升高而降低。这是由于当温度过低时，反应体系中的分子运动速度缓慢，不利于三萜的析出[17]；当温度过高时，反应体系中的八角茴香三萜受到破坏，从而降低了八角茴香三萜的得率。

图2 超声温度对八角茴香三萜得率的影响

2.1.1.3 超声时间对八角茴香三萜得率的影响

由图3可知，当超声时间大于40 min时，三萜得率的变化并不明显。当超声时间小于40 min时，八角茴香中三萜的得率随着超声时间的增长而迅速升高。这是由于当超声时间小于40 min时，超声能够增加溶液中分子运动速率，从而加大八角茴香中三萜的得率，当超声时间超过40 min时，反应体系中由于设备的温度迅速升高，破坏了已经提取的八角茴香中的三萜[18]。所以，选取超声提取时间40 min作为最优的八角茴香三萜提取时间。

图3 超声时间对八角茴香三萜得率的影响

2.1.1.4 液固比例对八角茴香三萜得率的影响

由图4可知，八角茴香中三萜的得率随着液固比例的增大呈现出先升高后降低的趋势，当液固比例为20∶1时，八角茴香中三萜的得率最高，为8.0 mg/g。当液固比例超过20∶1时，八角茴香中三萜的得率呈现缓缓下降的趋势。这是由于当液固比例小于20∶1时，增大液固比例能够增加反应体系中溶液的浓度。

图4 液固比例对八角茴香三萜得率的影响

2.1.2 正交试验结果与分析

选取A(乙醇浓度)、B(超声时间)和C(超声温度)作为变量，以八角茴香三萜得率为响应值，进行正交试验分析，设计试验方案及八角茴香三萜得率试验，结果见表2。

表2 正交试验及结果

由表2可知乙醇浓度、超声时间和超声温度对八角茴香中三萜得率的影响情况，其中乙醇浓度的影响最明显，其次是超声时间，影响最不明显的是超声温度，即A>B>C。八角茴香中三萜得率的最优条件为A0B1C1，即乙醇浓度为60%，超声时间为60 min和超声温度为40 ℃。

2.2 MTT法检测八角茴香三萜对肿瘤细胞生长的影响

将4种癌细胞(宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞和肺癌细胞)分别接种至96孔板并进行培养，当细胞长至70%的汇合度时，分别添加浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL的八角茴香三萜处理36 h。使用MTT法测定细胞的生长速率，由表3可知，八角茴香三萜对4种癌细胞均存在抑制作用，乳腺癌细胞和肺癌细胞抑制的最小八角茴香三萜浓度为0.3 mg/mL，宫颈癌细胞和结肠癌细胞抑制的最小八角茴香三萜浓度为0.2 mg/mL。随着八角茴香三萜浓度的增大，其对4种癌细胞的抑制效果都明显增强。说明八角茴香三萜对4种肿瘤细胞均有一定的抑制作用，但存在浓度的依赖性，不同种类的肿瘤细胞的最小作用浓度存在一定的差异[19-20]。

表3 不同的八角茴香三萜浓度对4种癌细胞生长速率的影响

3 结论

八角茴香果实干燥之后能够入药，具有理气、健胃止呕、祛风、镇痛等功效，是我国典型药食同源的经济作物。八角茴香精油在食品工业、饮料业、化妆品和制造业方面具有广泛的用途。随着社会经济的发展，八角茴香中的三萜成分也开始被研究人员关注。本研究基于此，通过正交试验对八角茴香三萜提取工艺进行优化，获得最佳八角茴香三萜提取工艺为乙醇浓度60%、超声时间60 min、超声温度40 ℃和液固比例20∶1。同时研究结果也表明八角茴香三萜具有一定的抗肿瘤作用。