不同类型标本中Xpert Mtb/RIF法检测结核分枝杆菌的效能比较

朱育连，陈丹丹，欧阳小娟，王旭洲，朱灵华

(中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院病理科，福建 福州 350000)

结核病是临床多发的慢性传染性疾病，通常侵及肺部，结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)是引起结核病的病原菌[1]。据世界卫生组织调查统计，全球每年结核病病例达800～1 000万，其作为造成死亡人数最多的单一传染病，已成为威胁全球民众健康安全的公共卫生问题[2]。MTB可经消化道、呼吸道及皮肤黏膜损伤侵入机体，早期潜伏在人体内，并在组织细胞内大量繁殖，其菌体成分和代谢物质毒性可诱导机体发生免疫损伤，故早期检测MTB至关重要。

实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert Mtb/RIF)为一种以利福平耐药相关rpoΒ基因为靶基因的全自动半巢式实时PCR体外诊断技术，可在2 h内快速检测MTB和利福平耐药[3]。经过对既往文献[4]的总结，本研究发现该技术在结核病诊断及其利福平耐药中具有检测高效快速，短时间获取结果的优势，可为初诊患者争取最佳治疗时间。但国内外鲜有研究报道该技术在不同类型标本中的诊断效能。本研究对比Xpert Mtb/RIF检测痰标本、肺泡灌洗液、浆膜腔积液及脓液等不同类型标本中MTB阳性率及利福平耐药性的灵敏度。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年2月至2019年2月中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院收治的497例肺结核患者，年龄(49.35±8.71)岁，男性257例,女性240例。纳入标准：所有患者均符合肺结核诊断标准[5]；入组前未接受抗结核药物治疗。剔除临床资料不完整者。收集痰标本205例，肺泡灌洗液221例，浆膜腔积液202例，脓液179例，其中有135例患者同时获得4种标本。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 Xpert MTB/RIF GeneXpert系统(美国Cepheid公司)，BACTEC MGIT 960系统及配套培养基(美国BD公司)、抗酸染色试剂、消化液(美国BD公司)，抗酸染液(珠海BASO公司)等。

1.2.2 MTB检测 取2 mL标本用N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠化处理，强力旋涡震荡后室温静置，加入磷酸盐缓冲液，离心15 min后弃去上清液，沉淀后制备成悬浊液，取0.5 mL接种于培养管，采用BACTEC MGIT 960系统进行培养，培养阳性的样本进一步以最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)法进行结核药敏试验。

1.2.3 Xpert Mtb/RIF检测 取1 mL体液标本加入前处理管中，视样本性状加入两倍处理液，旋紧螺旋盖，灌洗液经离心后加入处理液，涡旋振荡15～30 s，室温静置。充分液化后用专用无菌吸管吸取2 mL处理后样本缓慢加入Cartridge单独反应盒内，放入检测模块开始进行自动化检测，约2 h后加入盒子，在Xpert MTB/RIF GeneXpert系统中直接读取MTB和利福平耐药性结果。对MTB结果判读根据DNA拷贝的高低分为高、中、低、极低和未检出5个量级；RIF药敏结果分为RIF Resistance检出，RIF耐药和RIF Resistance未检出，RIF敏感[6]。

1.2.4 质量控制 本实验操作人员均参加并通过中国疾病预防控制中心组织的结核病实验室药敏测试及全国结核病分子诊断技术能力验证等培训及考试。

1.3 统计学分析

应用SPSS 22.0软件对数据进行处理与分析。分类变量资料以[n(%)]表示，组间采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同标本中MTB培养和Xpert Mtb/RIF检测MTB的阳性率对比

807例标本中MTB培养检测阳性515例，Xpert Mtb/RIF检测阳性584例，阳性率分别为63.82%、72.37%。Xpert Mtb/RIF多标本联合检测及各标本单独检测的阳性率均高于MTB培养(P<0.05)。

MTB培养和Xpert Mtb/RIF多标本联合检测的阳性率均高于单一标本检测，MTB培养和Xpert Mtb/RIF在肺泡灌洗液、痰标本、脓液和浆膜腔积液中检测出MTB的阳性率不同，其中在肺泡灌洗液中检测出MTB的阳性率最高，其次是脓液；第三是痰标本；最低的是浆膜腔积液，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同标本中MTB培养和Xpert Mtb/RIF检测MTB的阳性率对比[n(%)]

2.2 Xpert Mtb/RIF在不同标本中检测结核分枝杆菌利福平耐药性的灵敏度和特异度对比

497例患者在痰标本、肺泡灌洗液、浆膜腔积液、脓液标本及多标本联合中Xpert Mtb/RIF检测利福平耐药性的灵敏度、特异度分别为79.27%、72.11%；84.15%、80.08%；86.59%、86.06%；93.09%、83.27%；97.15%、85.26%，不同类型标本检测结核分枝杆菌利福平耐药性的灵敏度和特异度比较,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 Xpert Mtb/RIF在不同标本中检测结核分枝杆菌利福平耐药性的灵敏度和特异度对比[n(%)]

3 讨论

抗结核治疗的原则是尽早治疗，制定合理的联合用药方案，并按制定的方案完成全部疗程。临床上，结核的治疗主要以口服抗结核药物为主，并辅助对症治疗及手术治疗[7-8]。一般情况下，耐药性肺结核患者由于体内的结核分枝杆菌对一种或多种抗结核药产生耐药性，多为获得性耐药，此类患者的治疗周期需更长时间，给家庭和社会带来沉重负担[9-10]。由于耐多药结核病的筛查率低、发现率低、耐药率高，而传统的涂片抗酸染色法的检测灵敏度较低，MTB培养法需获取活菌培养2～6周，耗时较长。因此耐药结核的规范治疗关键是尽早诊断及进行药敏试验指导的个体化治疗。

长期以来，肺结核的诊断以实验室、影像学和病理学检查为主，MTB培养阳性率亦相对较低[11-12]。本研究结果显示，Xpert Mtb/RIF多标本联合检测及各标本单独检测的阳性率均高于MTB培养(P<0.05)，与既往研究[13]基本一致，证实Xpert Mtb/RIF检测在早期诊断肺结核中的优势。Xpert Mtb/RIF检测是近年来研发的一种分子生物学诊断技术，其可不受MTB影响，因此可将MTB及利福平耐药检测缩短至2 h，进而最大程度简化MTB检测[14]。已有大量研究就Xpert Mtb/RIF检测在结核病诊断应用中的价值进行过评估，如熊梦园等[15]在2020年的一项研究中就指出，与涂片抗酸染色镜检等传统方法相比，Xpert Mtb/RIF检测技术的灵敏度、特异度更高，并且对结核杆菌利福平耐药性的鉴定准确性高。尽管如此，Xpert Mtb/RIF检测在利福平耐药和结核分枝杆菌培养检测中只有平均敏感度，标本类型对该技术的检测效能的影响尚无定论[16]。

本研究结果显示，Xpert Mtb/RIF在肺泡灌洗液、浆膜腔积液、脓液和痰标本这四种不同类型标本中的阳性率以肺泡灌洗液最高，其次为脓液；且以药物敏感试验为金标准，不同类型标本检测结核分枝杆菌利福平耐药性的灵敏度和特异度比较差异有统计学意义(P<0.05)。这提示临床采用Xpert Mtb/RIF测定MTB阳性情况时收集不同类型的结核标本，将对肺结核的诊断大有裨益，对加快诊断速度亦有积极意义，其中以肺泡灌洗液的诊断价值最高。进一步分析其中的原因，肺泡灌洗液是利用纤维支气管镜对肺段和肺亚段灌洗后所采集的肺泡表面衬液[17-18]。肺泡灌洗液是距离肺结核患者发生炎症或病变部位最近的标本，因此该标本获得的阳性率远高于痰标本和浆膜腔积液[19]。另外，在肺结核发病早期，由于MTB数量多，变态反应性较强，此时组织器官中的炎性介质及蛋白质因血管渗透性较高而渗出到血管外，故此时病变以渗出的脓液为主，收集患者脓液也有助于检测MTB阳性情况[20-21]。同时，本研究结果显示多标本联合检测的阳性率均高于单一标本检测(P<0.05)，表明多标本联合检测可进一步提高患者早期诊断的阳性率。

综上，GeneXpert Mtb/RIF检测结核MTB均有较高的灵敏度，可作为检测结核分枝杆菌的有效方法。联合检测多种标本，特别是肺泡灌洗液有助于提高Xpert Mtb/RIF诊断肺结核及利福平耐药性的准确性。