拟南芥CGP1基因启动子克隆及其GUS转基因植株的构建

朱香豫, 吴 席, 陶曼芝, 王婷婷, 贾亚峰, 曹树青

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

随着现代化工业的发展,大量废弃物随之排放至外界环境中,其中不免会有一些有毒害的重金属废弃物,最终会造成土壤中重金属污染,这也成为当代农业科学的研究热点之一[1]。由于人类活动频繁导致重金属污染,最终造成生态环境恶化,其中重金属镉污染对农作物的生长危害极大,且具有生物累积性[2-3]。农作物中的镉通过食物链传递最终会累积至人体内,引起一系列生理疾病,如心血管疾病、高血压等[4]。镉对植物的危害本质上是由于镉离子(Cd2+)会导致活性氧代谢失衡,损害细胞膜结构,从而使其生理代谢发生紊乱。

植物在受到镉胁迫时引起信号转导,包括激发对镉摄取、转运和解毒的相关基因表达、合成与逆境相关的蛋白和分子信号,通过复合调控网络来适应和降低自身受到的镉毒害水平[5]。因此通过植物转基因技术使重金属富集到植物体中从而改善土壤重金属污染问题，是目前最经济有效且前景广阔的植物修复技术[6]。为探究基因CGP1在拟南芥中响应重金属镉胁迫的作用,本文通过克隆CGP1基因启动子,构建CGP1启动子接GUS载体的转基因材料,以研究CGP1基因的表达模式和响应镉胁迫的表达变化,为探究CGP1基因的功能及其在响应镉胁迫中的信号通路奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料

植物材料是生态型为哥伦比亚(Columbia,Col) 遗传背景的野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana),购于美国拟南芥种质资源中心(TAIR),后由本实验室繁殖所得;载体质粒为pART27(GUS载体)大肠杆菌DH5α,农杆菌GV3101。

1.1.2 主要试剂

San Taq PCR Mix (Sangon Biotech-B639295), Prime STAR Max Premix (TaKaRa-#R045), 限制性核酸内切酶HindⅢ(NEB-#R3104V),KpnⅠ(NEB-#R3142V), T4-DNA Ligase(NEB-#M0202S), dNTP Mixture Solution (Sangon Biotech-A610056), TIAN prep Mini Plasmid Kit(TIANGEN-DP103), TIANgel Midi Purification Kit (TIANGEN-DP209), DNA marker (TransGen-BM101), Tris-HCl(1185-53-1), NaCl(7647-14-5), EDTA(60-00-4), SDS(151-21-3), GUS Blue KIT(华越洋GT0391-50), 异丙醇(67-63-0),无水乙醇(64-17-5),1/2Murashige Skoog(Caisson-MSP08)等。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥的培养

配制营养土,将黑土高温高压灭菌20 min后进行人工粉碎,按照珍珠岩、黑土、蛭石体积比为1∶3∶9的比例混合均匀装入土培盆,再放到托盘中浸透营养液,最后用润湿的牙签沾取种子进行点种。

1.2.2 拟南芥全基因组DNA的提取

取培养2周后的野生型拟南芥叶片,与玻璃珠一起放入1.5 mL EP管中，经液氮研磨充分后加入400 μL DNA提取液(SDS)后剧烈混匀,12 000 r/min、 4 ℃下离心10 min,吸取200 μL上清于新的离心管中,加入等体积异丙醇溶液翻转混匀后12 000 r/min室温离心10 min,除去上清液，再加800 μL 70%乙醇,12 000 r/min离心5 min洗去杂质去上清,将沉淀放在通风橱下吹12 min,沉淀吹干后加入35 μL无菌双蒸水,-20 ℃冷冻保存。

1.2.3 克隆CGP1启动区基因片段及酶切连接

在TAIR网站上查询拟南芥CGP1基因的启动子序列,长度为2 000 bp,利用Oligo7.0软件设计以下引物进行CGP1启动子区域克隆:ProCGP1-FP:5’-GGGGTACCTTCTTCTGCATTATTGTCGC-3’;ProCGP1P-R:5’-CCCAAGCTTCTAGAGATGAGAATCCATG-3’。

该引物酶切位点为KpnⅠ、HindⅢ,模板为拟南芥全基因组DNA。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系为25 μL,采用的Prime STAR Max Premix为高保真DNA聚合酶,其扩增效率为1 000～2 000 bp/min,PCR反应条件为:98 ℃预热5 min;98 ℃变性10 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸2 min,扩增36个循环;72 ℃延伸5 min。将扩增出来的启动子片段以及pART7-GUS质粒用限制性核酸内切酶KpnⅠ、HindⅢ双酶切后用T4-DNA Ligase在16 ℃连接10～14 h。

1.2.4 大肠杆菌热激转化

低温取出大肠杆菌DH5α,冰上解冻后加5 μL连接产物轻轻混匀,冰浴30 min后进行水浴42 ℃热激60 s,再放置冰上,2 min后加600 μL LB培养基放入摇床培养1 h。菌液浑浊后涂布在加有壮观霉素抗性的LB固体培养基上,然后进行挑菌鉴定、测序和提取质粒。

1.2.5 电击转化农杆菌及浸染花序

将农杆菌感受态细胞GV3101置于冰上解冻,取2 μL测序结果比对正确的ProCGP1-GUS重组载体质粒,加到感受态细胞中轻轻混合,再吸取至提前预冷的1 cm电击杯中,放入电击仪在电脉冲5 μF、电压1 800 V条件下电击2次,再培养摇菌涂布到含有庆大霉素和壮观霉素双抗性LB平板上,2 d后挑单克隆菌落培养,PCR鉴定后接种于含有庆大霉素和壮观霉素双抗性LB液体培养基中,培养至OD600为1.0～1.4,高速离心去上清后加入侵染缓冲液重悬菌体,使菌体OD600为0.8～1.0,最后加SilwettL-77使其终体积分数为0.02%,颠倒混匀待用。选取5～6周的已结出花序和长角果的野生型拟南芥避光侵染花序,侵染前提前剪去果荚,黑暗处理12 h后光照培养,1周后不剪果荚再次侵染。

侵染缓冲液配方如下:1/2MS培养基用量为0.218 g;sucrose用量为6 g;SilwettL-77用量为25 μL;ddH2O定容至100 mL。

1.2.6 转基因阳性植株的鉴定

收取侵染后成熟的拟南芥种子记为T0代,经0.1%HgCl2杀菌消毒后撒在含有卡那霉素抗性的1/2MS固体培养基中进行筛选,培养10 d左右后移栽叶片深绿且根长的幼苗到营养土里,提取DNA经PCR鉴定正确后,得到转基因阳性植株,再经过后期性状分离纯化得到纯合体种子。

2 结果与分析

2.1 启动区基因片段克隆

为探究CGP1基因在拟南芥中响应重金属镉胁迫的作用,构建ProCGP1-GUS重组载体。取野生型拟南芥种子播种于营养土中,于温室中培养4周后取其莲座叶用SDS法提取拟南芥全基因组DNA,以此DNA作为模板,使用引物ProCGP1-FP、ProCGP1-RP以及高保真DNA聚合酶进行PCR序列扩增,完成后在PCR产物中加入Loading Buffer进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1所示。

从图1可以看出，条带大小约2 000 bp,与所选取的启动子区域长度一致。

2.2 载体和目的片段双酶切

选用GUS载体上所包含的酶切位点,而在ProCGP1片段上不含相应酶切位点碱基序列的2个限制性核酸内切酶KpnⅠ和HindⅢ对载体pART7-GUS和ProCGP1进行共同双酶切。酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测,如图2所示,图2中,M1为2 000 bp Marker;M2为10 000 bp Marker。由图2可知,酶切后的目的基因条带和载体质粒清晰，且大小与实际相符。

2.3 重组载体转化大肠杆菌后阳性克隆鉴定

将酶切后的载体质粒和基因片段进行胶回收,测回收产物DNA质量浓度,按照质粒与目的片段质量比约1∶3的比例通过T4-DNA Ligase连接,10 μL体系16 ℃连接10～14 h。吸取5 μL连接产物,采用热激转化法转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,然后挑取单克隆菌落到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中,培养完成后进行菌落PCR鉴定,结果如图3所示,图3中,M为2 000 bp Marker;1～9分别代表转化后大肠杆菌的PCR条带。由图3可知,1、3、7、9号菌落PCR条带与CGP1基因启动子片段大小一致,选取3号菌进行测序,测序结果经过DNAMAN软件序列比对后发现与CGP1基因启动子序列吻合,表明ProCGP1-GUS载体构建成功。

2.4 ProCGP1-GUS载体转化农杆菌及侵染

选取测序正确的ProCGP1-GUS载体质粒通过电击转化法转入农杆菌GV3101感受态细胞,2 d后挑取可以生长在庆大霉素和壮观霉素双抗性LB培养基上的菌落进行PCR鉴定,鉴定结果如图4所示,图4中,M为2 000 bp Marker;1～9分别代表转化后农杆菌单菌落的PCR条带。从图4可以看出,1、4、6、7、9号菌落PCR条带与CGP1启动子基因片段大小一致,选取7号阳性菌通过浸花法侵染拟南芥花序,1周后再次侵染,以提高转基因效率。

2.5 转基因阳性植株的获取

收取侵染后的拟南芥种子置于室温中干燥处理7 d,随后置于4 ℃条件下春化3 d。种子经0.1%氯化汞消毒冲洗后撒在含有50 μg/mL 卡那霉素抗性的1/2MS培养基上,置于22 ℃培养箱中培养2周,观察种子萌发和生长状态,阳性植株因其含有卡那霉素抗性基因,因此可以在含有卡那霉素抗性的培养基上生长,而未构建成功的则会表现为不发芽和叶片黄化的状态,抗性筛选结果如图5所示。

将生长正常且根长、叶绿的幼苗移栽至营养土中,将其置于22 ℃恒温气候培养室中光照培养。约4周后提取筛选获得的阳性植株DNA进行PCR鉴定,鉴定结果如图6所示,图6中,M为2 000 bp Marker。由图6可知，筛选的植株均为ProCGP1-GUS转基因阳性植株。

阳性植株逐代繁殖单株收种后点在含有50 μg/mL卡那霉素抗性的1/2MS培养基上,培养2周后,植株如图7所示。

由图7可知,野生型植株(WT)叶片萎黄或不发芽,而ProCGP1-GUS转基因植株叶绿根长且生长状态正常,因此可以初步确定为纯合体植株。

3 讨 论

土壤重金属污染日益严重,尤其是重金属镉毒害作用较强,且可以在植物的不同部位累积,当累积重金属的植物进入生态循环中,最终会危害人类身体健康[7-9]，因此研究植物对镉胁迫的响应机理对于修复土壤和农业生产方面影响深远[10]。而植物如何感受外界环境变化以及响应重金属胁迫,并对自身生长发育进行相应的系统调控并不完全明确[11]。随着分子生物学领域的发展,通过基因克隆和重组的方法来研究重金属镉相关基因的功能及其表达模式具有重要意义。本研究通过基因工程技术和分子遗传学手段获得了拟南芥ProCGP1-GUS转基因植物的纯合体材料,并利用GUS报告基因的特性来研究基因CGP1在植物组织中的表达。同时构建的转基因ProCGP1-GUS阳性植株为后续阐明CGP1基因的功能及其在响应镉胁迫中的作用提供了依据。