鱼腥草水、醇提取物对4种常见致病菌的体外抑菌效果*

朱怡珂 李定国 田 勇 余奕颖 田 博 曹 妮 刘 君

(海南医学院病原生物学与免疫学实验室，海南 海口 571199)

鱼腥草(Houttuynia cordata thunb)，双子叶植被三白草科的蕺菜属，植物学名称蕺菜。其挥发油癸酰乙醛(Decanoylacetal dehyde)，即鱼腥草素，是产生鱼腥味的主要成分[1]。鱼腥草在我国生长广泛，不仅含有各种营养元素，还具有多糖、生物碱、有机酸、黄酮以及挥发油类等各种药用成分，是一类富有经济利用价值的药食同源的野生植物[2，3]。现代科学研究证实，鱼腥草有止痛、抗菌、耐病毒、抗老化、抗氧化、抗射线、增强机体免疫、减少应激和氧化反应、利尿、止血及降血糖等作用[4-6]。

本实验以鱼腥草为实验对象，分别利用无菌水、乙醇提取其有效成分，对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)进行体外抑菌实验，探讨鱼腥草的不同提取方法对人体4种常见致病菌的抑菌活性和特性[7]。为鱼腥草的进一步开发利用和体外抑菌效果的研究提供科学依据。

1 材料与试剂

1.1 实验材料 新鲜鱼腥草地下茎，在海南省海口市山高村农贸市场购买。

痢疾志贺氏菌(GDMCC801366)，金黄黄葡萄球菌(GDMCC1.2442)，大肠埃希菌(GDMCC1.737)，伤寒沙门氏菌(GDMCC1.2777)，购于广东微生物菌种保藏中心。

1.2 供试仪器与试剂 GR60DR立式自动压力蒸发灭菌器[致微(厦门)仪器有限公司]；420-B恒温水箱(江苏大唐医疗器械有限公司)；HR40-ⅡA2生物安全柜(青岛海尔生物医疗股份有限公司)；SW-CJ-1FD清洁控制系统(苏州安泰空气技术有限公司)；SPX-250B-Z生化培养箱(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)；FX-200GD电子天平(东莞市稳象科技有限公司)等。无水乙醇(HPLC级，德国默克公司)；营养肉汤培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)等。

1.3 提取方法

1.3.1 直接研磨法 称取20 g洗净后的新鲜鱼腥草，研磨充分，取研磨液密封备用。

1.3.2 水提取法 称取20 g洗净后的新鲜鱼腥草，加入4 mL无菌水，研磨充分，取研磨液密封备用。

1.3.3 无水乙醇提取法 取20 g洗净后的新鲜鱼腥草，捣碎，然后置于500 mL的圆底烧瓶中，再添加约40 mL的无水乙醇，经冷凝回流，水浴加热3 h(加热过程在通风橱中完成)，最终将提取物倒入无菌烧杯中置于室温下自然挥发24 h，挥发完全后，加入4 mL的无菌水备用。

1.4 实验步骤 用麦氏比浊法得到4种菌的0.5浊度菌液，再配比4倍稀释液、8倍稀释液。制作直接研磨法、水提取法以及乙醇提取法的鱼腥草提取液(物)的药敏纸片。将每种菌的0.5浊度菌液，4倍和8倍稀释液分别涂布平板，每个平板置3种药敏纸片，对照组为无菌水药敏纸片、空白药敏纸片和空白平板。放入生化培养箱，37 ℃培养8 h。重复上述实验步骤3次，得到3组重复样本(平行样本数为6)。观察并记录结果，测量抑菌环的大小。

2 结果

2.1 鱼腥草3种提取方法提取物的抑菌效果 实验中直接研磨法、水提取法、乙醇提取法的提取物对大肠埃希菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)有不同程度的抑菌作用，而对伤寒沙门菌(S.typhi)均没有观察到明显抑制效果。抑菌效果大致上随菌液浓度增大而减小。见表1。

3种提取方法的提取物对E.coli的抑制作用均有显著性差异，且抑制强弱程度依次为：水提取法>直接研磨法>乙醇提取法。直接研磨法的提取物与水提取法的提取物对S.aureus的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)，2种方法的提取物均与乙醇提取法的提取物差异有统计学意义(P<0.05)，抑制强弱程度依次为：水提取法=直接研磨法>乙醇提取法。3种提取方法的提取物对S.flexner的抑制强弱程度依次为：水提取法=直接研磨法>乙醇提取法。见图1。

表1 不同提取方法下不同菌种的抑菌环大小

注：*P≤0.05；**P≤0.01；***P<0.001;****P<0.0001。图1 鱼腥草3种提取物对E.coli、S.aureus、S.flexner的 抑制效果(0.5浊度菌液)

2.2 鱼腥草提取物对3种菌的抑制效果差异 直接研磨液对E.coli、S.aureus和S.flexner3种细菌的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)。水提取液对E.coli和S.flexner，S.aureus和S.flexner的抑制效果差异有统计学意义(P<0.05)；而对E.coli和S.aureus的抑制作用差异无统计学意义(P>0.05)，抑制作用强弱依次为：E.coli=S.aureus>S.flexner。乙醇提取液对S.aureus和S.flexner的抑制效果差异有统计学意义(P<0.05)，且对S.aureus的抑制作用强于S.flexner，而E.coli与二者均差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.3 抑菌环直径随菌液稀释倍数变化规律 理论上抑菌环直径随菌液稀释倍数增大而增大。但本实验测得的稀释倍数-抑菌环直径曲线与理性模型不完全一致(见图2)，这可能与细菌生长速度、培养时间以及培养过程中pH值变化有关。

图2 抑菌环直径随菌液稀释倍数变化规律

3 讨论

实验过程中采购的不同批次的鱼腥草的抑菌效果有差异，可能与鱼腥草的新鲜程度、生长时间、植株部位、地理位置和植株遗传因素等方面的差异有关。鱼腥草越新鲜，抑菌效果越明显。本实验的鱼腥草均在4 ℃冷藏12 h以内，此时实验效果最好。在预实验中，当冷藏保存36 h以上时，抑菌效果明显减小且抑菌圈周围观察到明显杂菌环，说明有效抑菌成分失活且腐败菌滋生。鱼腥草的地上组成部分的生长发育可分成出苗期、旺长期、静止期、枯萎期和冬眠期5期，地下部分成长的过程可分成出苗期、旺长期、静止期和冬眠期4期。不同生长周期的鱼腥草营养成分也有明显差异[8]。鱼腥草的活性成分含量和抗氧化功能从部位上看，叶片>地上茎>根状茎，呈由上往下逐步减少的趋势[9]。本实验选用鱼腥草根状茎，故猜测鱼腥草不同部位的抑菌效果大小依次为叶片>地上茎>根状茎，有待后续实验进一步研究。此外，不同地理位置鱼腥草的活性成分有所不同，但鱼腥草群体间的地理分布和遗传多样性分布没有直接的相关性，即海拔、纬度和经度等的变化还不足以影响鱼腥草的遗传多样性水平[10]。

除了鱼腥草自身的因素，培养基的酸碱度、菌种的迭代培养、提取方法、细菌的生长速度等因素也会影响抑菌环的直径。大部分细菌的生命活动受氢离子浓度的影响很大，一般而言，在弱酸条件下活力最高，且鱼腥草中一些活性成分如多酚等可通过离子配位结合改变其抑菌能力[11]，所以不同pH条件对鱼腥草的抑菌作用的影响较为复杂。除此之外，实验过程中菌种的迭代培养也可能导致基金突变，产生耐药性，从而影响抑菌效果。新鲜鱼腥草的抑菌物质主要为具有挥发性的总黄酮、挥发油、多糖等[12]。不同提取方法对鱼腥草活性成分的提取程度不同。目前对鱼腥草抗菌物质研究得比较多的是鱼腥草素，但本试验中具体抗菌物质。其中乙醇提取法的抑菌效果并不理想，可能与提取工艺和器材条件有关，导致有效活性成分的损失。本实验对伤寒沙门氏菌未观察到抑制作用，查阅相关文献也未见相关报道。本实验细菌培养条件为37 ℃，8 h，细菌生长速度也很大程度影响实验结果。金黄色葡萄球菌的繁殖速率最快，3个浓度梯度的培养皿37 ℃培养8 h，菌落生长的密度差别最小。痢疾志贺氏菌生长速度最慢，3个浓度梯度的培养皿的菌落密度差别最明显。因此，痢疾志贺氏菌的不同浓度梯度的抑菌环的直径差小于理想值，可能与细菌生长较慢、药液抑菌活性减弱有关。

总的来说，本实验初步探究了鱼腥草的抑菌作用，为鱼腥草抑菌类产品的研发与推广提供了理论依据。我国鱼腥草分布范围广，中医学中运用广泛且历史悠久。目前临床上常见的药品复方鱼腥草颗粒、鱼腥草滴眼液等。鱼腥草所含有的活性成分对多种细菌和真菌具有抑制作用[13]，这为鱼腥草在缓解皮肤病、雾化治疗肺炎、天然的食品添加剂和畜牧业饲料添加剂等方面的应用提供了可能。