线粒体钙稳态与ATP 生成双向调节机制的研究进展

陈思远，琚昊，王永侠

（浙江农林大学动物科技学院•动物医学院，浙江杭州 311300）

钙离子（Calcium Ions，Ca）参与凝血、神经递质和激素合成及酶活性调节等多种生理活动，是机体不可或缺的元素。Ca可通过激活三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle，TCA）的Ca敏感脱氢酶和氧化磷酸化（Ox idative Phosphorylation，OXPHOS）的F/F腺嘌呤核苷三磷酸合酶（Adenosine Triphosphate Synthase，ATPase），刺激腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）生成。线粒体内Ca浓度（Mitochondrial CaConcen tration，[Ca]）维持相对稳定的状态称为线粒体钙稳态。线粒体钙稳态失衡会导致线粒体功能发生障碍，致使ATP 的生成量大幅减少。同时，线粒体ATP 生成减少也会对线粒体钙稳态造成影响。目前学界有大量针对线粒体钙稳态及ATP 生成的研究，但详细讲述线粒体钙稳态和ATP 生成之间的关系尤其是这二者如何相互影响的文章尚且较少。本文将着重阐述线粒体钙稳态和ATP 生成之间的双向调控机制以及两者在畜牧生产中对动物繁殖的影响，为线粒体钙稳态的维持和ATP生成的良性循环在畜禽繁殖中的作用提供理论参考。

1 线粒体钙稳态维持与其对ATP 生成的影响

在静息状态下，细胞质内Ca浓度（Cytoplasmic CaConcentration，[Ca]）在某一较低水平（大约为0.1 μmol/L）维持不变。由于线粒体外膜具有Ca高通透性，此时 [Ca]与 [Ca]相当。在细胞受到刺激引发Ca内流且达到一定浓度时，线粒体吸收Ca，当刺激消失后又释放Ca，由此起到缓冲胞内Ca剧烈波动的作用。

线粒体Ca是调节ATP 生成的关键因子，在正常生理状态下，[Ca]水平可动态调节ATP 的生成。ATP 在细胞分解代谢营养物质的过程中产生，其主要生成部位在线粒体中OXPHOS 的位置。ATP 的生成过程分为糖酵解和TCA 2 个阶段。在糖酵解阶段，葡萄糖在细胞质内经一系列酶解反应生成水、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NADH）、ATP 和丙酮酸；丙酮酸转运进入线粒体后经丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate Dehydrogenase Complex，PDC）催化生成NADH 及乙酰辅酶A；乙酰辅酶A 经TCA 循环生成二氧化碳、三磷酸鸟苷（Guanosine Triphosphate）、NADH 和还原黄腺嘌呤二核苷酸（Reduced Flavine Adenine Dinucleotide，FADH2）。NADH 和FADH中的电子经OXPHOS 上多种酶和辅酶的催化转移给氧气，并在此过程中逐步释放能量，并由此泵送氢离子（Hydrogen Ion，H）进入线粒体内膜，建立H浓度梯度。最后，ATPase 利用H梯度的电化学能合成ATP。

Ca进入线粒体基质后可激活TCA 循环中的限速酶，包括PDC、异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate Dehydroge nase，IDH）和-酮戊二酸脱氢酶复合体（Oxoglutarate Dehydrogenase Complex，OGDC）来有效提高ATP 产生。

PDC 是一种由多个亚基构成的复合物，包括丙酮酸脱氢酶（Pyruvate Dehydrogenase，E1）、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶（Dihydrolipoamide Acetyltransferase，E2）和二氢硫辛酰胺脱氢酶（Dihydrolipoamide Dehydr ogenase，E3）3 种催化酶及丙酮酸脱氢酶激酶（Pyruvate dehydrogenase Kinase，PDK）和丙酮酸脱氢酶磷酸酶（Pyruvate Dehydrogenase Phosphatase，PDP）2 种调节因子和二氢硫辛酰胺脱氢酶结合蛋白（Dihydrolipoamide Dehydrogenase-Binding Protein，E3BP）及3 种辅助因子。PDC 活性受PDK 和PDP 调节，可由PDK 磷酸化失活，又可经PDP 去磷酸化恢复活性。PDP 存在2 种异构体，其中PDP1 活性受到Ca调节。当PDP1与Ca结合，PDP1 活性增强。因此，Ca能通过与PDC 结构域的结合与否来调节酶活性。

IDH 可分为2 类，分别与烟酰胺嘌呤二核苷磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）2 种辅酶结合。在真核生物中，前者存在于细胞质和线粒体，而后一种存在于线粒体。Ca通过竞争性结合异柠檬酸来抑制IDH 酶活性。已有研究证明，在生理浓度下，[Ca]升高可增加OGDC活性。

2 线粒体钙超载及其对ATP 生成的影响

线粒体钙超载即[Ca]异常增加，导致线粒体出现结构损伤和功能障碍的现象。引发线粒体钙超载的因素包括肥胖、衰老和剧烈运动等。线粒体钙超载不利于线粒体内裂变融合平衡的维持，可破坏线粒体的结构和功能，由此将进一步破坏线粒体Ca稳态。

在病理状态下，线粒体钙超载能使线粒体膜去极化，活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）增加，导致线粒体功能障碍；并通过线粒体膜的通透性转换孔（Permeability Transition Pore of Mitochondrial Memb rane，mPTP）、细胞色素c（Cytochrome c，Cyt c）、一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）、电子传递链（Electron Transport Chain，ETC）复合物I 和复合物IV 影响ATP 生成。

mPTP 分子结构复杂，关于其构成目前尚无定论，但现已普遍认为亲环蛋白D（Cyclophilin D，CypD）是mPTP 上唯一关键的活性蛋白。最近的研究表明腺嘌呤核苷酸转位酶（Adenine Nucleotide Translocase，ANT）和ATPase也参与PTP 构成。在高[Ca]情况下，CypD 可通过调控线粒体基质间的离子交换致使线粒体发生肿胀，促使mPTP 打开，导致线粒体出现功能障碍，进而造成细胞死亡。mPTP的开放常伴随着Cyt c 的释放。研究表明Cyt c 的释放与细胞凋亡相关。Cyt c 位于线粒体的嵴上，可作为一种传递电子的载体参与生物氧化反应；或在凋亡初始阶段与带负电的心磷脂（Cardiolipin，CL）结合，催化线粒体内膜脂质过氧化。高[Ca]会促进ROS生成，ROS 能使CL 过氧化，使其重新分布到线粒体外膜，由此促进mPTP 的形成及Cyt c 的释放。Cyt c能调控ROS 的产生和清除，它的流失会进一步加重过量ROS 引起的线粒体氧化应激，破坏线粒体功能。

NOS 具有3 种类型的同工酶，分别是神经元型、内皮型和诱导型NOS，其中前两者为钙依赖型。有研究指出，Ca浓度的依赖性增加能激发神经和内皮NOS 活性，刺激一氧化氮（Nitric Oxide，NO）的产生，而NO 能影响线粒体功能及ATP 的生成过程。研究发现NO 能通过以下多种方式抑制线粒体的呼吸过程，从而减少ATP 的产生：其一，NO 通过与高[Ca]结合的间接反应抑制复合物I；其二，NO 通过与氧竞争，直接与细胞色素c 氧化酶（Cytochrome c Oxidase，复合物IV）可逆结合，抑制其活性；其三，NO 易与超氧阴离子自由基（Superoxide Anion Radical）结合生成活性 氮（Reactive Nitrogen Species，RNS），RNS通过损伤ETC 上酶的活性抑制呼吸作用。

3 ATP 对线粒体钙稳态的影响

肌质膜Ca-ATPase（Sarcoplasmic Reticulum Ca-ATPase，SERCA）是一种可跨膜进行阳离子转运的ATP酶，对Ca存在较高的亲和性，能利用ATP 水解的能量通过主动转运把胞质内Ca泵入内质网，维持细胞内钙稳态。SERCA 有3 个基因编码并具有多种亚型，其中管家蛋白SERCA2b 内包含3 个负责介导ATP 结合和水解的结构域。SERCA 活性受多种因素调节，常见的有膜磷蛋白（Phospholamban）和解偶联肌钙蛋白（Sarcolipin）2 种跨膜蛋白，后者通过破坏SERCA对Ca的亲和力，导致细胞内Ca失衡。线粒体ATP 生成下降会减少内质网Ca摄取，造成内质网应激，进而导致SERCA 表达活性下降，细胞内Ca的循环和平衡破坏，[Ca]增加，线粒体Ca内流加大，最终导致线粒体钙稳态失衡。此外，有研究发现姜黄素可能通过阻止ATP 结合内质网的方式导致SERCA 的ATP 依赖性Ca摄取被抑制。

4 钙稳态及ATP 生成对畜禽繁殖的影响

4.1 钙稳态及ATP 生成对卵母细胞的影响 卵母细胞的发育过程中会出现2 次停滞，第1 次是在动物性成熟前，大量初级卵母细胞停留在第1 次减数分裂前期；第2 次是次级卵母细胞进入输卵管后停留在第2 次减数分裂中期，只有当精子进入卵母细胞后才继续完成分裂。在此过程中，精子上的特异性磷脂酶C Zeta（Phospholipase C Zeta）会使磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯（Phosphatidylinositol 4，5-Bisphosphate）裂解产生肌醇三磷酸（Inositol Triphosphate），后者可与肌醇1，4，5-三磷酸受体1（Inositol 1，4，5-Trisphosphate Receptor 1，IP3R1）结合，打开Ca通道。IP3R1 介导的Ca释放和SERCA 介导的Ca摄取之间相互作用产生了Ca振荡，促使第2 次减数分裂恢复，因此维持适当的钙稳态对卵母细胞的进一步发育至关重要。[Ca]波动可影响线粒体代谢，引发线粒体钙超载，当卵母细胞内发生线粒体钙超载会导致减数分裂恢复的延迟。

卵母细胞内的线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）可作为遗传物质遗传给后代，但因缺乏保护性组蛋白和自身修复DNA 能力低等原因，较易发生突变。然而细胞进行有氧呼吸时难免在mtDNA 附近产生ROS，为减少ROS 诱导的突变，细胞通过抑制线粒体活性的方式降低突变频率，以较低水平的ATP 维持生命活动。卵母细胞的ATP 水平又与受精率及胚胎发育呈正相关，低于阈值水平的ATP 可能会影响卵母细胞发育的进程以及进一步的胚胎发育。ATP 还能够改变Ca振荡的频率和持续时间，在哺乳动物卵母细胞受精过程中起重要作用。此外，线粒体的数量、结构和分布模式会随着卵母细胞由不成熟发展到早期胚胎阶段的不同而转变，如不成熟的卵母细胞内部会缺少线粒体组织或出现较大的线粒体团块。

4.2 钙稳态及ATP 生成对精子的影响 精子在进入雌性生殖道前，以休眠的状态存储在附睾中，由附睾液为其提供环境支持。附睾液的特征之一是Ca梯度沿附睾小管下降，这意味着在附睾内存在着一套钙稳态调节机制。附睾内局部钙稳态受损会导致公鸡出现附睾结石，严重影响公鸡的生育能力。此外，线粒体Ca超载会损伤公鸡体外存储精子的功能。另有研究表明，精子中Ca水平升高会增加顶体反应中精子鞭毛的强度，导致过度活化的增加。

精子在进入雌性生殖道后因出现理化和生物学改变而获能，随后与卵膜上蛋白特异性结合发生顶体反应。精子获取能量的方式有2 种，一种是线粒体上的OXPHOS，另一种是发生于鞭毛头部和纤维鞘的糖酵解。研究发现2 种ATP 生成途径的作用并不完全一致，且首选途径受到物种差异和环境底物的影响。有研究证明由热应激（Heat Stress）造成的线粒体活性下调及ATP 合成的损伤将导致猪精子活力的降低。

4.3 钙稳态及ATP 生成对胚胎发育的影响 钙稳态及ATP 生成对畜禽繁殖率的影响并不单纯停留在影响精子和卵子的活力及发育方面，而是在整个胚胎发育过程中都有着重要作用。

在禽类养殖生产中，影响孵化率的主要因素之一就是蛋壳质量。蛋壳生物矿化的过程中需要大量的钙，这对钙稳态造成了极大的挑战。虽然雌性禽类在产蛋期间会通过增加每日钙摄入量、增加钙溶解量并优化肠道对钙的吸收等特定代谢调节方式来维持钙稳态，但日粮中钙供应不足或胃肠道钙吸收不当，机体便会通过增加骨髓的动员来满足暂时的高钙需求。然而这一过程有限且不可持续，因此钙稳态的紊乱将导致家禽骨骼矿化、骨质疏松及体重减轻，同时造成蛋壳质量不佳而使孵化率降低。在猪和牛等哺乳动物的早期胚胎发育中，调节线粒体钙稳态对受精卵母细胞维持线粒体功能和促进囊泡进一步发育同样具有重要作用。研究发现神经节苷脂GT1b 在猪卵母细胞成熟的过程中可通过维持[Ca]来减少ROS 产生，进而避免氧化应激引起的胚胎发育率降低。

ATP 供应的不足除了不利于生殖细胞的发育成熟外，还会导致卵母细胞胞质分裂异常甚至破裂，降低受精率。线粒体作为ATP 产生的重要来源，对卵母细胞成熟、受精和胚胎发育至关重要。早期卵裂期胚胎内的线粒体完全继承于卵母细胞，且数量保持不变，因此需要极大地依赖与多种细胞内底物（即丙酮酸、脂肪酸和谷氨酰胺）的OXPHOS 来产生ATP。Liu 等发现在鸡胚胎快速生长的时期，糖酵解I/ 糖异生I 及TCA 循环II 同样增加。研究发现给老年母猪补充原型辅酶Q和积雪草酸可以明显降低细胞内ROS 水平，增加 ATP 的产量与活性，从而改善胚胎的质量及后续发育。综上所述，不论是作为信号分子的Ca还是ATP，都能从多个方面对生殖细胞的活性和质量以及胚胎进一步的发育产生影响。钙稳态的失衡及ATP 生成的不足最终将降低畜禽的繁殖效率。

5 小结与展望

线粒体作为细胞内重要的细胞器，以产生ATP、维持细胞钙稳态和调控细胞凋亡等功能为人们熟知。线粒体在缓冲胞质Ca波动的同时仍需要维持自身内部的钙平衡，这与线粒体其他功能的发挥息息相关。根据上述内容，可以更加清晰地认识到，线粒体钙稳态和钙超载可分别通过TCA 限速酶及mPTP 孔、Cyt c、NOS和ETC 上的复合物来调控ATP 生成，而ATP 的生成又能经SERCA 反过来影响线粒体钙稳态。不论是线粒体钙超载的发生还是ATP 生成减少，都可能导致线粒体功能障碍，最终造成细胞损伤甚至死亡。在畜禽养殖上，要注意二者在畜禽生殖细胞成熟和胚胎发育方面发挥的作用，维持线粒体钙稳态和ATP 生成之间的良性循环，以求更加有效地提高畜禽的繁殖性能。