寒地玉米秸秆不同腐熟时期的理化性状及微生物多样性分析

王丽娟，刘 丹，徐永清，冯 旭，贺付蒙，李爱雨，王 雪，杨 燕，李翠婷，袁 强，李凤兰

(东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

作为农业大国，我国种植的农作物种类繁多，秸秆产量居世界第一位。但在传统模式下，每年约有30%的秸秆没有得到充分的利用而直接被丢弃或就地燃烧[1-2]，这不仅使秸秆资源得不到充分的利用，同时对生态环境造成严重影响[3]。农作物秸秆中的主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，它们互相包被缠连，呈现一种复杂的层状结构，使得秸秆的降解工作变得较为困难，致使秸秆资源的高效开发利用难以实现[4]。东北地区作为我国主要的粮食生产基地，每年均会产生大量的农作物秸秆，通过腐熟方法以秸秆为原材料进行生物有机肥的生产或抛洒还田是秸秆无害化处理和资源重新利用的途径之一，但漫长的冬季和较低的气温致使秸秆腐熟难以在户外大规模开展。由于北方低温期较长，秸秆还田后分解较慢，达不到预期的效果[5]。因此，在低温条件下高效腐熟秸秆的方法对东北地区秸秆资源的充分利用具有重要的意义。

秸秆腐熟剂是根据微生物的营养机理而制成的复合菌剂，由数十种酶类、无机添加剂及多种高效有益微生物组成，能使秸秆等农业废弃物快速分解、释放养分的微生物菌剂[6]。腐熟菌剂中的一些微生物具有较强的环境适应能力，可有效地降解农作物秸秆，加快形成植物可利用的营养物质[7]。针对东北地区秸秆腐熟难的问题，东北农业大学李凤兰[8]研究团队自主研发了寒地低温秸秆腐熟菌剂及其体系，有效地解决了环境温度较低的情况下秸秆难以完成腐熟的难题。在完成秋收后，低温秸秆腐熟菌剂可在寒冷条件下使农作物秸秆快速降解，能够在较短的时间内达到理想的腐熟效果。

为了探究在施用低温秸秆腐熟菌剂后，发酵垛内秸秆的理化性质变化及微生物菌群的多样性改变，本研究以东北地区常见的玉米秸秆为材料，对寒冷气候条件下玉米秸秆的室外腐熟过程进行全程监测，以发酵垛温度、物质组成含量、营养成分及微生物多样性角度系统阐明低温秸秆腐熟菌剂对玉米秸秆腐熟的作用、过程和机制，为寒地条件下秸秆等农业废弃物的腐熟再利用和无害化处理提供相关参考依据和数据支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

玉米秸秆取自东北农业大学内试验田，寒地低温秸秆腐熟菌剂由东北农业大学菌剂研发中心提供。

1.2 试验设计

玉米秸秆腐熟堆肥试验于黑龙江省坤昊生物科技有限公司发酵场进行。对收割后的玉米秸秆进行喷水处理，调整其含水量至70%，再按照秸秆质量的5%喷洒低温秸秆腐熟菌剂，利用机器将秸秆进行堆垛高3.5～5.0 m，按每1 000 kg秸秆添加2 kg尿素，调节C/N比为25∶1进行露天腐熟。玉米秸秆腐熟时间为90 d，在腐熟中期进行翻搅一次。

秸秆腐熟过程中，每6 d测定并分别记录当天的环境温度和发酵垛内温度。根据垛内温度的高低确定腐熟的5个时期并在不同的腐熟时期内采集秸秆样品，每个时期取样均采取五点取样法，在离垛表面25 cm处取1 kg样品。采集的所有秸秆样品均保存后统一进行测定，对于分子生物学试验，样品于-80 ℃密封保存；对于理化性质测定试验，样品自然风干后进行粉碎，过1 mm筛，室温干燥避光保存。

1.3 试验方法

1.3.1 理化性质的测定 将不同腐熟时期的玉米秸秆样品切成2 mm×2 mm大小，通过扫描电子显微镜对秸秆茎的内表皮部分进行形态结构观察。通过酸碱消煮法[9]处理样品，采用纤维素测定仪测定样品中纤维素、半纤维素、木质素的含量。样品中全氮的测定采用凯氏定氮法 NY/T 1121.24-2012；全磷采用全磷测定法 NY/T 88-1988；全钾采用全钾测定法 NY/T 87-1988。铵态氮、速效磷、有效钾、有机质均采用托普云农公司的试剂盒用土壤养分测定仪(TPY-6A)进行测定，具体操作步骤参照说明书。

1.3.2 微生物多样性测定 采用高通量测序方法对样品中微生物的多样性进行测定，测序工作由北京百迈克公司完成。采用OMEGATM试剂盒提取样品的基因组，具体方法参照说明书。细菌的扩增区域为16S V3+V4，引物序列为：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；真菌的扩增区域为ITS1，引物序列为：ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′。ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR反应体系为：基因组DNA 50 ng±20%，Vn F/R各0.3 μL，KOD FX Neo Buffer 5 μL，KOD FX Neo 2 μL和ddH2O补齐至10 μL。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共20个循环；72 ℃ 7 min。PCR反应结束后的产物进行纯化再进行Solexa PCR，20 μL的Solexa PCR反应体系为：PCR 纯化产物5 μL，MPPI-a/b(2 μmol/L)各2.5 μL，2×Q5 HF MM 10 μL。反应条件为：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共10个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃+∞。使用USEARCH[10]，Version 10.0在相似性97%的水平上对序列进行聚类，并以测序所有序列的0.005%作为阈值过滤OTU[11]。

1.3.3 物种注释及分析学分析 数据库选择：细菌16S∶Silva[12]；真菌ITS∶Unite[13]，采用RDPClassifier[14]的分类方式对OTU进行物种分类。

1.4 数据处理

所有试验均至少重复3次，数据显示为平均值±标准差(Mean±s)，本研究采用Microsoft Excel 2007进行数据统计，采用GraphPad Prism 8软件制图并进行差异显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 寒地玉米秸秆腐熟过程中的动态变化

2.1.1 寒地玉米秸秆腐熟过程中温度的变化 测量农场环境温度变化及垛内温度变化是取样当天测量温度的均值，在整个腐熟过程当中，环境最高温度为-7 ℃，最低温度为-23 ℃。发酵起始的垛内温度为8 ℃(图1)，此时为腐熟初始期(A1)；经过7 d的腐熟，发酵垛内温度逐步升高，为腐熟的升温期(A2),此时发酵垛内温度达到59.7 ℃；待发酵垛内温度达到60 ℃以上，进入腐熟期(A3)；此后发酵垛内温度保持在60 ℃以上，这段时期为腐熟平稳期(A4)，在这期间的环境温度最低达到-22 ℃，发酵垛内温度最高达70 ℃；在腐熟第50 天，监测到发酵垛内开始降温，温度降到45 ℃左右，此时为腐熟降温期(A5)；在腐熟60 d后，温度又有小幅度的升高。

图1 玉米秸秆腐熟过程中温度的变化Fig.1 Change of temperature during corn straw decomposition

2.1.2 玉米秸秆腐熟过程中的形态分析 通过扫描电镜观察玉米秸秆在腐熟过程中内表皮的形态变化。对照组的玉米秸秆未经腐熟过程，其内表皮结构的蜡质层光滑规则、平整并且致密(图2-CK)。初始期的玉米秸秆表面结构开始分解(图2-A1)，随腐熟过程的推进，与对照组相比，升温期玉米秸秆的平整结构被打乱，结构变得疏松(图2-A2)。进入腐熟期后，玉米秸秆的表面变得粗糙，纤维的内部受到破坏和分解(图2-A3)。经过微生物活动激烈的腐熟期后，腐熟过程玉米秸秆进入平稳期，此时秸秆的纤维结构排列变得杂乱无章并出现大小不一的孔隙(图2-A4)。待进入降温期后，玉米秸秆内表皮纤维的内部结构被完全暴露出来，变得十分疏松(图2-A5)。对腐熟完成的秸秆观察结果显示，纤维结构被破坏的程度与对照组相比十分明显。

CK.对照；A1.初始期；A2.升温期；A3.腐熟期；A4.平稳期；A5.降温期。CK.Control；A1.Initial stage；A2.Warming stage；A3.Ripening stage；A4.Stable stage；A5.Cooling stage.

2.1.3 玉米秸秆木质纤维素成分相对含量的变化 随着腐熟过程的推进，发酵垛内玉米秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素含量都有明显变化。由图3可知，在A1时期，秸秆中纤维素的含量为54.54%，并随时间的推进呈逐渐下降的趋势，并在A5时期降至33.48%，且与A1时期呈显著差异(P<0.05)。秸秆中半纤维素含量的变化与纤维素含量的变化趋势相似，均随腐熟时间的延长逐渐降低。在A1时期，秸秆中半纤维素的含量为32.00%；A5时期，其降至16.57%。与纤维素和半纤维素含量变化趋势相反，秸秆中木质素的含量随腐熟时间的延长逐渐上升，在A1时期，木质素的含量为5.95%，在发酵结束后这一比例上升至11.40%。

不同小写字母表示处理间差异达显著水平(P<0.05)。图4，5同。Different lowercase letters in the same concentration was significant difference(P < 0.05).The same asFig.4，5.

2.2 寒地玉米秸秆腐熟过程中发酵物的营养物质含量的变化

2.2.1 全氮、全磷、全钾、有机质含量变化 腐熟过程中发酵物全氮的含量呈整体上升趋势，在A1时期，全氮含量为0.31 mg/g，A2时期显著下降。随着腐熟过程的推进全氮含量急剧上升，到A4时期的含量为1.47 mg/g(图4-A)。发酵物中的全磷含量变化如图4-B所示，A1时期的全磷含量为7.38 mg/g，进入A3时期，全磷含量上升至86.38 mg/g，但在A4时期全磷含量相比A3下降了48.98%，待腐熟进入A5时期，全磷含量上升至211.12 mg/g。全钾含量的变化如图4-C所示，发酵物内全钾含量腐熟的过程中呈波动趋势，在A1时期为118.95 mg/g，待进入A2时期含量上升了12.67%，到A4时期全钾含量上升至最大值156.73 mg/g，在进入A5时期全钾含量相比A4时期又急剧下降了42.45%。腐熟过程发酵物中有机质含量的变化如图4-D所示，有机质的含量在腐熟全程均呈下降趋势，A1时期的含量为299.8 g/kg，腐熟进入A5时期有机质含量显著下降至149.7 g/kg。

图4 玉米秸秆腐熟过程中全氮、全磷、全钾和有机质的含量变化Fig.4 Content changes of total nitrogen，total phosphorus，total potassium and organic matter in corn straw during decomposition

2.2.2 铵态氮、速效磷、有效钾含量变化 玉米秸秆在腐熟过程中铵态氮、速效磷和有效钾的含量发生了不同变化。由图5可知，发酵物中铵态氮在A1时期的含量为326 mg/kg，随后在A2—A5时期含量下降至253.71 mg/kg后缓慢增长，并在A5时期含量为307.46 mg/kg。速效磷含量的变化幅度在腐熟全程中变化较小，A1时期的含量为81.69 mg/kg，A2—A3时期均呈下降的趋势，但不显著，随后在A4时期显著上升(P< 0.05)，含量达到最高值108.51 mg/kg，但在A5时期又降至59.47 mg/kg。对于发酵物中有效钾含量的变化呈波动趋势，分别在A2、A4时期上升，A3和A5时期下降，最低值为A5时期的279.42 mg/kg，最高值为A2时期的406.66 mg/kg。

2.3 寒地玉米秸秆腐熟过程中微生物的多样性分析

2.3.1 腐熟过程中细菌多样性分析 稀释度曲线可表示出各处理样品的测序量能否准确反映样品中物种的多样性，并间接反映出样品中物种的丰富度程度。由各处理样品的稀释度曲线可得出，当曲线越发平稳，OTU数量不再变化时，表明所得到的数据是合理可用的(图6-A)。寒地玉米秸秆腐熟时期共有203种细菌物种，其中A1、A2、A4、A5时期特有3，1，1，27种细菌物种(图6-B)。对所有细菌物种在属水平上进行物种分类分析如图6-C所示，A1时期假单孢菌属(Pseudomonas)和芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)的相对丰度较高，随着腐熟的推进，其相对丰度逐渐降低。A2时期出现莱斯氏属(Laceyella)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)，其A3时期鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)为优势菌种，其相对丰度为45.75%，而在A4时期降低。A5时期地芽孢杆菌属和嗜热双孢菌属(Thermobispora)占主要优势。

A.样品稀释度曲线；B.微生物OTU数量的韦恩图；C.腐熟过程中在属水平上的物种组成。图7同。A.Sample dilution curve；B.Venn diagram of microbial OTU numbers；C.Species composition at the genus level during decomposition.The same asFig.7.

2.3.2 腐熟过程中真菌多样性分析 由图7-A可知，各个样品的曲线逐渐趋于平稳，说明样品数据是合理可用的。寒地玉米秸秆腐熟过程中共有119种真菌物种，其中A1、A3、A5时期特有真菌菌种为2，1，4种(图7-B)。对寒地玉米秸秆腐熟的各个时期的真菌多样性进行监测(图7-C)，A1时期主要以亚隔孢壳菌属(Didymella)和耐冷酵母属(Guehomyces)为优势菌属；A2时期的耐冷菌属继续增多，其相对丰度达到82.68%；A3时期出现毁丝霉菌属(Myceliophthora)；A4时期毁丝霉菌属、嗜热链球菌属(Mycothermus)、嗜热真菌属(Thermomyces)和鬼伞属(Coprinus)占优势菌属，其中嗜热链球菌属的相对丰度为29.58%；在A5时期嗜热真菌属和耐冷酵母属为主要优势菌属，其中嗜热真菌属的相对丰度为38.83%。

图7 腐熟过程中真菌多样性分析Fig.7 Analysis of fungal diversity during decomposition

3 结论与讨论

降解秸秆的关键是利用各种手段筛选出高效降解木质纤维素的微生物，并在最适条件下生长代谢成为优势菌群，产生大量的相关酶系，在这一系列酶的共同作用下完成秸秆的降解过程[15]。研究表明，真菌降解木质素的能力显著高于细菌和放线菌，虽然部分真菌对木质素有较好的降解能力，但在高温发酵时其酶活变弱[16]。所以筛选在寒地和高温腐熟中均能稳定降解木质素的菌种，可以显著提高纤维素的降解效果。在本试验中，低温秸秆降解菌剂中的耐冷酵母属可在低温环境下活动旺盛，加快腐熟的进度，使发酵温度开始升高，玉米秸秆中的纤维素、半纤维素含量呈下降趋势，随着腐熟的推进，当发酵垛内温度达到60 ℃以上时，菌剂中嗜热微生物的耐热特性发挥优势，大分子有机物的降解速率开始加快，使纤维素、半纤维素含量继续呈下降趋势。而腐熟过程中木质素含量呈上升趋势，推测是木质素牢牢地包裹在纤维素和半纤维素的外面对其起保护作用，木质素难降解的原因导致的，在腐熟过程中其他物质的降解速度大于木质素降解的速度，进而使得木质纤维素相对含量上升[17]，同时表明温度的改变可导致优势菌种的改变。王秀红等[18]对玉米秸秆条垛式堆肥不同翻堆时期的细菌菌群进行分析发现，嗜热脲芽孢杆菌属、高温单孢菌属和芽孢杆菌属在发酵前期丰度较高，而梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、Chryseolinea和假单孢菌属在发酵后期丰度较高。在本试验中的前期，耐冷酵母属为主要优势菌属，丰度均达到50%以上，在整个堆肥时期起着重要作用，堆肥后期嗜热双孢菌属、嗜热真菌属起着重要作用。堆肥的不同时期优势功能微生物的种类及功能不同，所以使用高通量测序技术明确腐熟的各个时期的优势菌群的变化，对于未来菌剂组合的优化、提高腐熟效率具有重要意义[16]。

目前研究中高温(22～50 ℃)秸秆分解菌的筛选较多，而北方地区低温期较长，中高温微生物在低温(低于15 ℃)时生长受到抑制，不能代谢外源物质，因而常温和高温微生物菌剂不能充分发挥其功效[19]。但本研究使用的低温腐熟菌剂是针对低温地区研制的，可以使秸秆腐熟达到非常好的效果。研究表明，利用低温菌剂降解秸秆进行还田，能够加快秸秆的腐熟、增加土壤微生物数量、提高农作物产量[20]。陆水凤等[21]在堆肥中添加低温菌剂，发现腐熟时间缩短，提高了腐熟效果。本研究发现，在低温条件下使用低温腐熟菌剂后的第7天，垛内温度达到59.7 ℃，表明该菌剂中的低温微生物使垛内温度快速升高，加快了腐熟进程。青格尔等[22]在室内模拟试验比较了低温秸秆腐菌剂与其他腐解菌剂对玉米秸秆降解率和土壤养分及酶活性影响的差异，但本试验是在以自然田间条件下进行腐熟试验，有效避免了室内模拟试验的可能未能完全反映大田实际应用效果这一缺点，产生的结果也有助于在实际生产中提供相对准确的理论支持。

影响寒地秸秆腐解因素有很多，除腐熟剂外，与外界环境，秸秆的种类，还田数量、深度和方式以及土壤类型等都存在密切关联[21]。所以，今后的研究中为探寻该菌剂的腐熟效果，可以和其他低温腐熟菌剂在相同处理条件下进行比较。

在施用低温秸秆腐熟菌剂后，可在寒冷条件下进行快速发酵，7 d后发酵垛内平均温度在60 ℃左右，最高温度可达70 ℃以上，腐熟过程中秸秆内表面上的纤维束逐渐被破坏；腐熟后降温期时的纤维素相对含量降至33.48%，半纤维素的相对含量降至16.57%；有机质含量降低至149.7 g/kg；全氮、铵态氮含量呈先降低后升高的趋势；全磷、全钾、速效磷、速效钾呈波动状态。在腐熟初始期耐冷真菌属和假单孢菌属为主要菌属；在腐熟期鞘氨醇菌属和耐冷酵母属为主要菌属；在腐熟的平稳期和降温期中，嗜热微生物发挥着主要作用。