circKEAP1通过影响miR-661/LIF轴促进骨肉瘤细胞增殖和迁移*

黄晓文， 张能华△， 陈兴英， 袁 梅， 费春霞， 徐屹宁

（1浙江中医药大学附属嘉兴中医院检验科，浙江 嘉兴 314001；2浙江大学医学院附属邵逸夫医院骨科，浙江 杭州 310020）

骨肉瘤是来源于间叶组织最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于青少年及儿童，主要表现为骨骼或关节处的肿胀感与疼痛，活动后加剧，部分可触及肿块［1］。骨肉瘤的发病率约为3/100 万，占全世界相关年龄段肿瘤的2.4%［2］。过去几十年来，随着新辅助放化疗结合手术的应用，骨肉瘤的治疗方式有了显著的进步。尽管如此，骨肉瘤的患者预后仅有微小的提升。而伴有化疗耐药与肿瘤组织转移的骨肉瘤患者，其五年生存率仅为15%～30%［3］。骨肉瘤治疗目前尚无特异性的有效靶点。在体外水平寻找抑制骨肉瘤细胞增殖与迁移的靶点，是后续开发新型有效的临床治疗药物首要与关键步骤。

与传统的线性RNA 不同，环状RNA（circular RNA，circRNA）是一种呈现环状闭合结构的非编码RNA，不具备5'末端帽子和3'末端多聚腺苷酸尾巴，且有更高的稳定性，表现为对RNA 酶更高的耐受［4］。circRNA 广泛存在于机体各个组织器官中，在特定条件下具有一定的功能，与其他RNA 或蛋白共同维持生物体内微环境的稳态。circRNA 可与特定的蛋白相互作用，从而影响靶蛋白功能［5］。少部分circRNA被证明具有翻译功能，能够翻译蛋白或肽段行使其生物学功能［6-7］。此外，circRNA 存在广泛的微小RNA（microRNA，miRNA，miR）的结合位点，能够海绵吸附 miRNA 并调节其下游靶基因［8］。miRNA 是一类不具备编码功能的短核苷酸单链RNA 分子，参与转录后基因表达调控，在肿瘤发生和心血管疾病等生物学过程中发挥着重要作用［9］。其中，miR-661 被证明可通过调节细胞色素C 增强星形孢菌素或肿瘤坏死因子α介导的骨肉瘤细胞凋亡［10］。

此前有研究报道，circRNA circKEAP1 在系统性红斑狼疮患者外周血单核细胞中的表达量显著下调［11］。此外，还有学者报道 circKEAP1 对预测肺腺癌患者的生存率具有重要意义［12］。基因表达集合数据库（GSE140256）分析结果显示，circKEAP1 有较高的丰度，且在多个骨肉瘤细胞系中显著高表达。由此推断，我们探讨了circKEAP1 通过海绵吸附miR-661，进而调控其靶基因白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）影响骨肉瘤增殖与迁移的分子机制，并为探索基于circKEAP1-miR-661-LIF 轴的骨肉瘤新型治疗靶点提供依据。

材料和方法

1 材料

凋亡检测试剂盒购自BD；24孔Transwell板及小室购自Corning；CCK-8 和双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；小干扰RNA、miR-661 模拟物与miR-661 抑制剂购自上海吉玛制药技术有限公司；LIF过表达质粒购自汉恒生物科技（上海）有限公司；Lipofectamine 3000、胎牛血清、DMEM 高糖培养液、Opti-MEM 培养液、胰蛋白酶溶液和 PBS 购自 Thermo Fisher Scientific；总 RNA 提取试剂盒购自康为世纪生物科技股份有限公司；逆转录试剂购自艾科瑞生物；荧光定量PCR SYBR Green荧光染料购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；热稳定性的DNA 聚合酶（Taq 酶）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；放线菌素D 购自Selleck；引物购自北京擎科生物科技有限公司；

2 细胞

293T、143B、HOS、U2OS、SJSA-1、MG63 和hFOB1.19 细胞系均购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC），培养条件均为含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养液，培养环境为5%CO2、37 ℃恒温恒湿细胞培养箱。

3 主要方法

3.1 PCR 与RT-qPCR 根据总RNA 提取试剂盒说明书提取处理后的U2OS、HOS、MG63、143B、SJSA-1与hFOB1.19 细胞的总RNA。随后使用艾科瑞生物的逆转录试剂将总RNA 逆转录为互补DNA。PCR为 10 μL 体系，其中 2× Taq 酶取 5 μL，互补 DNA 取0.5 μL，正、反向引物各取 0.25 μL，去离子水取 4 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。将上述PCR 产物加入1%琼脂糖胶，120 V 恒压电泳30 min后显影。对于RT-qPCR，将β-actin 作为内参照。反应体系为 10 μL，其中 2× SYBR Green 预混液取 5 μL，正、反向引物各取0.25 μL，互补DNA 按照1∶10用去离子水稀释后取4.5 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环。采用 2-ΔΔCt方法计算 circKEAP1 及 KEAP1 的相对表达量。circKEAP1 的正向引物序列为5'-CGAGAAGTGTGTCCTCCACG-3'，反向引物序列为5'-CACTCAGGGACCTCCCCAAAAT-3'；KEAP1 的 正向引物序列为5'-CTGGAGGATCATACCAAGCAGG-3'，反向引物序列为5'-GGATACCCTCAATGGACACCAC-3'；β-actin 的正向引物序列为 5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3'，反向引物序列为5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。

3.2 质粒构建 选择上海汉恒生物科技有限公司的 pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO 载体，依次加入载体DNA（1 g/L）、10×Buffer、超纯水、限制性核酸内切酶（EcoR I和BamH I）试剂，轻轻吸打混匀，置于37 ℃水浴锅中反应2 h；酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。设计的引物进行目的片段PCR 扩增后，琼脂糖凝胶回收得到正确大小的目的片段。将目的基因片段（大于100 ng）、线性化载体、无缝克隆试剂预混液与超纯水配置克隆连接体系，于在50 ℃反应30 min后，置于冰上5 min。随后将DH5α 感受态细胞从-80 ℃冰箱拿出来之后立刻放到冰上融化，加入1 μL目的质粒，冰上放置30 min，42 ℃热激90 s，立刻插入冰上冰育2 min，随后加入 500 μL 不含抗生素的 Luria-Bertani（LB）肉汤培养液，在37 ℃恒温摇床上震荡培养60 min。将菌液涂到相应抗性的固体平板上，涂布均匀，然后将板倒放37 ℃恒温箱培养16 h。次日，挑阳性单克隆，进行测序，确认序列无误后，使用质粒抽提试剂盒对质粒进行扩增抽提。

3.3 细胞转染 将细胞接种于6 孔板中，待其生长到50%～60%密度备用转染。准备两个微型离心管，分别加入100 μL 的Opti-MEM 培养液。对于小干扰RNA 的转染，在第 1 个微型离心管中加入 5 μL 的 Lipofectamine 3000，另一个微型离心管中加入10 μL 20 μmol/L 浓度的小干扰RNA，将两个微型离心管共孵育15 min 后，将上述样品滴入细胞培养液中。对于质粒的转染，在第1 个微型离心管中加入5 μL 的Lipofectamine 3000，另1个微型离心管中加入1 μg浓度的质粒，并加入2 μL P3000。将两个微型离心管中的溶液共孵育15 min 后，再将上述样品滴入细胞培养液中。24 h后，换用新鲜的培养液继续培养。

3.4 CCK-8 法检测细胞活力 将细胞接种于96 孔板，转染si-circKEAP1 或miR-661 抑制剂或过表达LIF 后，将处于对数生长期的143B 细胞取出，弃去培养液，用PBS 溶液洗涤一遍后加入含有10% CCK-8溶液的培养液，进一步培养2 h。随后将96孔板置于酶标仪检测450 nm 的吸光度（A）值，并计算细胞活力。

3.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将细胞接种于6孔板，转染si-circKEAP1或miR-661 抑制剂或过表达LIF 后，将处于对数生长期的143B 细胞取出。使用PBS 溶液洗涤细胞，随后使用无EDTA 的胰蛋白酶溶液将细胞消化下来，再次用PBS 溶液洗涤后，使用400 μL Binding Buffer重悬细胞。向上述样品中加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）并在避光条件下孵育15 min。最后将样品置于流式细胞仪中上机，并分析细胞凋亡比例。

3.6 细胞迁移实验 将细胞接种于6 孔板，转染sicircKEAP1 或 miR-661 抑制剂或过表达 LIF 后，将细胞消化并离心重悬计数，均匀的铺在24 孔Transwell板上层小室。上层小室中加入无血清培养液，下层加入含有10%胎牛血清的培养液。24 h 后使用4%多聚甲醛固定，在孔板中加入结晶紫染液染色1 h，随后使用清水洗净。取出Transwell 上层小室，擦去上层多余的细胞，置于显微镜下观察，并记录典型视野。

3.7 萤光素酶报告基因实验 将293T 细胞接种于24 孔板中，每组设置3 个复孔，待其贴壁并生长达到密度50%～60%。将1.5 μL Lipofectamine 3000试剂、1 μL P3000试剂、500 ng对应萤光素酶报告基因质粒（野生型或突变型）及3 μL 标准浓度的miR-661 模拟物（或miR 阴性对照）于无血清Opti-MEM 培养液中共孵育15 min，并转染入293T 细胞中。36 h 后参照双萤光素酶报告基因检测试剂盒说明书，使用裂解液裂解细胞并加入萤火虫萤光素酶底物，通过化学发光仪检测萤火虫荧光素酶活性，随后检测海肾萤光素酶活性，计算萤火虫萤光素酶与海肾萤光素酶活性的比值。

3.8 Western blot 实验 将三羟甲基氨基甲烷3.02 g、甘氨酸18.8 g 和十二烷基硫酸钠1 g 加水溶解，定容至1 L，制成电泳液。将三羟甲基氨基甲烷5.8 g、甘氨酸2.9 g 和十二烷基硫酸钠0.376 g 加水溶解，定容至800 mL，并加入200 mL 甲醇，制成转膜液。组装电泳槽，倒入电泳液，在配好的SDS-PAGE 胶中每孔加入15 μg 蛋白样品与适量蛋白标准品。接通电泳仪电源后，首先以恒压80 V 进行电泳，随后以120 V 恒压电泳直至样品移动至分离胶末端。将PVDF 膜置于甲醇中激活，随后将海绵、双层滤纸、凝胶、PVDF 膜、双层滤纸，海绵从下到上依次安装并夹紧。根据目标蛋白的分子量大小，在冰浴中按280 mA 恒流的条件转膜90 min。使用TBST 溶液配制5%的牛血清白蛋白溶液，将PDVF 膜置于配置好的牛血清白蛋白溶液中室温封闭1 h。TBST漂洗后，将对应PVDF 膜裁剪后置于对应配置好的Ⅰ抗中，4 ℃摇床孵育过夜或室温下孵育1 h。取出PVDF 膜，使用TBST 溶液洗涤3 次，每次10 min。将与Ⅰ抗对应种属的Ⅱ抗按1∶10 000 的比例配制于5%牛血清白蛋白溶液中，将PVDF 膜置于含有Ⅱ抗的溶液中，于室温在摇床上缓慢孵育1.5 h。取出PVDF 膜，使用TBST 溶液洗涤3 次，每次10 min。使用电化学超敏发光液进行曝光显影。使用ImageJ 软件对目标条带进行灰度定量分析。

从“伙伴”到“对手”：《美国国家安全战略报告》的话语空间分析 ……………………… 刘文宇 徐博书（6.8）

4 统计学处理

用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析，KS检验数据符合正态分布，方差分析数据符合方差齐性。数据以均数±标准差（mean±SD）表示，两两比较比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 circKEAP1 在骨肉瘤细胞系中表达上调，且具有更高的稳定性

通过对基因表达集合数据库（GSE140256）的数据进行分析，我们筛选到在骨肉瘤组织中表达显著上调的circRNA circKEAP1，又名has_circ_0049271（图1A）。RT-qPCR 结果显示，相比于对照成骨细胞hFOB1.19，骨肉瘤细胞系 U2OS、HOS、MG63、143B和SJSA-1 中circKEAP1 具有较高的丰度，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1B。circKEAP1 是由其母基因KEAP1的2 号外显子自身成环形成，一代测序确认其circRNA 结构，且成环剪切位点为“TGGA”（图 1C）。PCR 结果显示，circKEAP1 仅存在于互补DNA 中，且不存在于基因组DNA 中。相比之下，其母基因KEAP1则同时存在于互补DNA 和基因组DNA 中（图1D）。此外，我们使用放线菌素D 抑制RNA 合成。RT-qPCR 结果显示，相比于 KEAP1 线性RNA，circKEAP1 具有更高的稳定性，12 和 24 h 降解速率有显著差异（P＜0.05或P＜0.01），见图1E。

2 circKEAP1 促进骨肉瘤细胞活力与迁移，抑制其凋亡

构建针对circKEAP1 环状剪切位点的小干扰RNA，使用 Lipofectamin 3000 将 si-circKEAP1 转染入143B 细 胞 。 RT-qPCR 结 果 显 示 ，143B 细 胞 中 的circKEAP1 表达显著下降（P＜0.01），见图2A。CCK-8 实验结果显示，敲减circKEAP1后，143B 细胞的活力显著降低，48 和72 h 相比差异有显著统计学意义（P＜0.01），见图2B。细胞迁移实验结果显示，敲减circKEAP1后，143B 细胞的迁移能力显著下降（P＜0.01），见图2C。此外，流式细胞凋术结果显示，敲减circKEAP1后，143B 细胞的凋亡比例显著上升（P＜0.01），见图2D。

3 circKEAP1 结合 miR-661 影响 143B 骨肉瘤细胞的活力和迁移

通过检索CircBank 数据库与CircInteractome 数据库，预测能与circKEAP1 结合的miRNA 并取二者交集。进一步通过生物信息学分析与文献检索，得到在骨肉瘤细胞中具有抑癌作用的miR-661（图3A）［10，13］。circKEAP1 与 miR-661 存在较高评分的结合位点（图3B）。构建miR-661 模拟物、野生型及突变型双萤光素酶报告质粒。双萤光素报告基因实验显示，miR-661 能与circKEAP1 结合，而不能与位点突变的 circKEAP1 结合（P＜0.01），见图 3C。构建miR-661 的抑制剂，将 si-circKEAP1 与 miR-661 抑制剂（或miRNA 抑制剂对照）共转染入143B 细胞。CCK-8 实验结果显示，miR-661 抑制剂能部分逆转敲减circKEAP1介导的细胞活力降低，在48 和72 h 有显著差异（P＜0.05 或P＜0.01），见图3D。细胞迁移实验结果显示，miR-661 抑制剂能部分逆转敲减circKEAP1引起的细胞迁移减少（P＜0.01），见图3E。此外，流式细胞细胞术结果显示，抑制miR-661 能部分逆转si-circKEAP1 介导的凋亡增加（P＜0.01），见图3F。

4 miR-661能与LIF相互作用

Figure 1. The characteristics of circKEAP1 and its expression alteration in osteosarcoma cells. A：the differential expression of circRNAs in osteosarcoma and its adjacent tissue in GSE140256；B：the expression level of circKEAP1 in osteoblast hFOB1.19 and different osteosarcoma cell lines including U2OS，HOS，MG63，143B and SJSA-1；C：schematic illustration demonstrated the formation of circKEAP1 via exon 2 of KEAP1，and the formation of circKEAP1 was validated using PCR followed by Sanger sequencing；D：PCR confirming the existence of circKEAP1 in 143B cells（circKEAP1 was amplified by divergent primers in cDNA but not gDNA，while KEAP1 was amplified by convergent primers in both cDNA and gDNA）；E：the expression levels of circKEAP1 and KEAP1 mRNA in 143B cells treated with actinomycin D at the indicated time points were detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs hFOB1.19 group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs circKEAP1 group.图1 circKEAP1的特性及其在骨肉瘤细胞中表达的改变

为进一步探究circKEAP1 发挥作用的下游靶基因，我们将转染si-circKEAP1 后的143B 骨肉瘤细胞进行转录组测序。热图显示敲减circKEAP1的143B细胞与对照差异RNA 表达情况（图4A）。TargetScan数据库预测miR-661下游有1 293个靶基因。将预测数据与转录组中下调的RNA 取交集，进一步生物信息学分析结合文献检索，可得高评分靶基因LIF（图4B）。在 143B 细胞中，使用 si-circKEAP1 敲减circKEAP1，进一步 RT-qPCR 分析显示 LIF 的 mRNA 水平显著下调（P＜0.01），见图4C。生物信息学分析结果显示LIF基因上有3 个miR-661 的结合位点，分别位于3'非翻译区135～157、983～1005 和1978～2001。分别构建针对3个位点的Luc-LIF突变型双萤光素酶报告质粒（以及Luc-LIF 野生型对照质粒），miR-661 模拟物（与miRNA 对照）在293T 中共转染。萤光素酶报告基因实验结果显示，miR-661 能与LIF 结合，且3个位点均有较强的结合能力（P＜0.01），见图4D。

Figure 2. circKEAP1 knockdown inhibited the viability and migration of 143B cells. A：the expression level of circKEAP1 evaluated by RT-qPCR；B：CCK-8 assay showing the viability of 143B cells transfected with si-circKEAP1 at 24，48 and 72 h；C：Transwell assay demonstrating the migration ability of 143B cells after circKEAP1 knockdown（scale bar=100 μm）；D：flow cytometry detecting the apoptosis rate change after 143B cells transfected with si-circKEAP1. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs NC group.图2 敲减circKRAP1抑制骨肉瘤细胞143B的活力和迁移

5 circKEAP1通过LIF提高骨肉瘤细胞活力并促进其迁移

Figure 3. circKEAP1 enhanced the viability and migration of 143B cells through miR-661. A：Venn diagram demonstrating the targeted miRNAs of circKEAP1 predicted by CircBank and CircInteractome database；B：the interaction regions and the sequence of circKEAP1，miR-661 and mutant circKEAP1；C：luciferase reporter assay showing the interaction between circKEAP1 and miR-661；D：CCK-8 assay revealing the viability changes of 143B cells transfected with si-circKEAP1 and miR-661 inhibitor；E：Transwell assay showing the migration ability of 143B cells transfected with si-circKEAP1 and miR-661 inhibitor（scale bar=100 μm）；F：flow cytometry detecting the apoptosis rate change of 143B cells transfected with sicircKEAP1 and miR-661 inhibitor. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs NC+miR-NC group；△△P＜0.01 vs si-circKEAP1+miRNC group；##P＜0.01 vs Luc-circKEAP1 WT+mimic NC group；▲▲P＜0.01 vs Luc-circKEAP1 WT+miR-661 mimic group.图3 circKEAP1通过吸附miR-661促进骨肉瘤细胞活力与迁移

讨 论

Figure 4. miR-661 could interact with LIF. A：heatmap of RNA sequencing demonstrating the differential expression genes between 143B cells treated with si-circKEAP1 and controls；B：Venn diagram showing the overlap between target genes of miR-661 predicted by TargetScan database and down-regulated genes in RNA sequencing data；C：RT-qPCR revealing the LIF mRNA expression after circKEAP1 knockdown；D：luciferase reporter assay exhibiting the interaction between LIF and miR-661 in the 3 predicted binding sites（diagram illustrates the sequences of the 3 binding sites）. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs Luc-LIF WT+mimic NC group；△△P＜0.01 vs Luc-LIF WT+miR-661 mimic group；##P＜0.01 vs NC group.图4 miR-661能与LIF基因相互作用

circRNA 是一种共价闭环的非编码RNA，不具备5'末端帽子和3'末端多聚腺苷酸尾巴。40 多年前，circRNA 首次被发现。随后很长一段时间，这种RNA 被认为是一种无意义的剪切产物［14］。然而，近些年随着高通量测序及针对circRNA 生物信息算法的发展，越来越多的circRNA 在真核细胞中被发现并鉴定，且呈现出一定的组织特异性分布［15］。大部分circRNA 定位于细胞质，经可变剪切从编码蛋白的基因中产生。通常circRNA 由一个或多个外显子构成，也有少量由内含子或内含子联合外显子构成［16］。尽管circRNA 相对于线性基因表达丰度稍低，但其高度的稳定性使得circRNA 在许多病理生理过程中发挥着重要的作用。小鼠circRNA-42398通过调控TGF-β1/Smads 信号通路抑制肝星状细胞活化［17］。在结肠癌中高表达的circPTK2 可以与波形蛋白（vimentin）的Ser38、Ser55 和Ser82 位点相结合，促进结肠癌的进展。这也使得circPTK2 有望成为治疗结肠癌的潜在靶点［18］。在骨肉瘤中此前有研究报道，circECE1 通过竞争结合c-Myc 蛋白泛素化位点，减弱c-Myc蛋白泛素化降解，促进TXNIP转录进而促进骨肉瘤的瓦博格效应［19］。鉴于circRNA 重要的生物学功能与作用，寻找在特定疾病中具有较高丰度与稳定性的一类circRNA，可能是干预并治疗特病疾病，尤其是肿瘤的重要靶点。

Figure 5. LIF overexpression reversed circKEAP1 knockdown-induced inhibition of viability and migration of 143B cells. A：RT-qPCR revealing the mRNA expression of LIF in 143B cells transfected with si-circKEAP1 and LIF；B：Western blot revealing the protein expression of LIF in 143B cells transfected with si-circKEAP1 and LIF；C：CCK-8 assay demonstrating the viability of 143B cells transfected with si-circKEAP1 and LIF；D：Transwell assay showing the migration rate change of 143B cells transfected with si-circKEAP1 and LIF（scale bar=100 μm）；E：flow cytometry detecting the apoptosis rate change of 143B cells transfected with si-circKEAP1 and LIF. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC+Vec group；△△P＜0.01 vs si-circKEAP1+Vec group.图5 过表达LIF能逆转敲减circKEAP1介导的细胞活力和迁移抑制

本项研究中，我们通过分析基因表达集合数据库GSE140256，首次检测并筛选出在骨肉瘤组织中显著表达上调的circRNA circKEAP1。经RT-qPCR确认，相对于成骨细胞hFOB1.19，该circRNA在各骨肉瘤细胞系中高表达，同时使用放线菌素D 验证了其具有较高的稳定性。这表明circKEAP1 在骨肉瘤细胞中可能具有潜在的重要功能。circKEAP1 是由其线性转录本第2 号外显子成环而来，针对其剪切位点我们设计了小干扰RNA，通过敲减circKEAP1的方法，验证了其具有促进骨肉瘤细胞143B 增殖与迁移，同时抑制凋亡的功能。circRNA 具有较多微小RNA 结合位点，可通过海绵样吸附微小RNAs 发挥作用［4］。这也是circRNA 被报道最多的作用机制之一。因此通过分析数据库CircBank 与CircInteractome，结合文献报道miR-661可通过增强骨肉瘤凋亡抑制骨肉瘤进展，我们锁定了miR-661 可能是潜在的circKRAP1 下游之一。circKEAP1 表面具有miR-661的反应元件，我们通过萤光素酶报告基因实验验证了二者的结合。此外，抑制miR-661 可以部分逆转敲减circKEAP1对骨肉瘤细胞的抑制作用，这进一步验证了miR-661是circKEAP1的下游信号分子。

为进一步探究下游的效应基因，我们通过转录组测序分析筛选受circKEAP1 调控的基因，同时通过TargetScan 数据库生物信息学分析miR-661 下游靶基因，取二者交集，经过筛选得到LIF基因。LIF基因是白细胞介素6 细胞因子家族中最具多效性的成员之一，可激活多种信号通路，例如JAK/STAT 通路、MAPK 通路和PI3K 通路等。尽管如此，其在不同类型细胞中可能具有矛盾的相反作用，包括刺激或抑制细胞增殖、分化和存活等［20］。有学者报道，LIF可通过激活STAT3 通路促进骨肉瘤生长［21］。本研究中，我们验证了LIF可与miR-661相互作用，且3个结合位点均有较高的结合力。过表达LIF基因可部分逆转敲减circKEAP1介导的肿瘤增殖抑制、凋亡增加与迁移减弱。这表明，circKEAP1 可通过对miR-661的海绵吸附作用，进一步调控LIF，发挥其对骨肉瘤细胞的促肿瘤作用。当然，我们并不排除circKEAP1能够靶向其他微小RNA，或者通过结合其他RNA 结合蛋白，甚至发挥翻译作用引起骨肉瘤的生物学改变。该部分研究将在后续进一步展开。

综上所述，circKEAP1 能够通过吸附miR-661，进而调控其靶基因LIF，促进骨肉瘤细胞的增殖与迁移。在体外水平，circKEAP1-miR-661-LIF 轴是干预骨肉瘤细胞生物学行为的重要信号靶点，为骨肉瘤治疗提供了参考资料。