O-GlcNAc糖基化修饰对小鼠骨骼肌纤维的影响*

寇乐乐， 张 萌， 李晓双， 徐 彬， 李士泽

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

骨骼肌是一种横纹肌组织，它是动物机体储存营养的重要组织［1］，也是调节体内系统能量稳态最重要的生理组织，约占体质量的40%［2］，其功能丧失可以导致肌肉老化、肌肉损伤以及各种肌源性疾病［3］。骨骼肌发育是由一系列肌生成调节因子介导的复杂且严格调控的生物学过程［4］，骨骼肌可以将化学能转化为收缩和新陈代谢的能量［5］。肌纤维由慢（I 型）和快（II 型）纤维组成，慢纤维可以激活线粒体生物发生，主要利用氧化代谢作为能量产物，以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）来维持基本的稳定和活性，而快纤维则对糖酵解代谢有一定的依赖性，还会使线粒体的含量和氧化代谢能量降低［6］。骨骼肌纤维中包含不同的肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MyHC）亚型［7］，由 Myh7（I 型）、Myh2（IIa 型）、Myh1（IIx 型）和Myh4（IIb 型）组成，这些表达每种MyHC 亚型的肌纤维的相对丰度决定了肌肉的收缩力和速度［8］。在肌肉再生过程中，伴随有活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增加［9］，线粒体裂变信号传导的改变［10］等现象。骨骼肌依赖氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）来产生ATP［11］为其提供能量，因此骨骼肌内存在的线粒体网络对骨骼肌的新陈代谢过程有重要的意义。

O连接的N-乙酰葡萄糖胺（O-linkedN-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修饰是一种动态的翻译后修饰，是发生在蛋白质丝氨酸和苏氨酸羟基末端连接的乙酰氨基葡萄糖上的单糖基修饰［12］，O-GlcNAc 修饰 通 过O-GlcNAc 转 移 酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和O-GlcNAc 糖苷酶（O-GlcNAcase，OGA）两种酶［13］之间的动态循环过程将单糖转移到丝氨酸或苏氨酸羟基中发挥作用。O-GlcNAc 修饰［14］主要发生在多种核蛋白和胞质蛋白中，包括转录因子、细胞骨架蛋白、肿瘤基因和激酶等［15］，其参与的生物过程包括核苷酸代谢、糖代谢、胰岛素抵抗、损伤反应及细胞信号蛋白转运等。研究表明，特异性Ogt基因敲除小鼠在缺乏Ogt情况下全身能量消耗增加，线粒体功能损伤，肌肉收缩缓慢，对肌肉发育造成了一定的影响［16］，但O-GlcNAc 修饰对骨骼肌发育过程中的机制仍不明确。基于此，本研究旨在探讨O-GlcNAc 修饰对小鼠骨骼肌纤维转化的影响，为O-GlcNAc 修饰对小鼠骨骼肌发育过程中的机制提供科学依据。

材料和方法

1 材料

5 周龄SPF 级雄性Ogt基因肌肉特异性敲除（Ogt-/-）C57BL/6 小鼠和同窝雄性野生型（wild-type，WT）小鼠，体重 15～20 g，购自 Jackson Laboratory；Myh2抗体、Myh4抗体、Myh7抗体和α-tubulin 抗体购自Proteintech；超敏ECL化学发光试剂盒购自新赛美生物科技有限公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司。

2 方法

2.1 免疫荧光染色法检测骨骼肌纤维组成 为探讨Ogt敲除对骨骼肌纤维类型转化的影响，我们采集腓肠肌并对肌肉切片使用MyHC 抗体进行免疫荧光染色来检测Ogt敲除后小鼠骨骼肌纤维类型的变化。实验方法参考已发表的文献［17］。

2.2 Seahorse能量代谢分析仪检测骨骼肌线粒体能量代谢 使用Seahorse XFe24 能量代谢分析仪检测耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）［18］，OCR 参数包括基础有氧呼吸、有氧呼吸最大值和非线粒体呼吸等。在检测过程中，通过预先设定的程序，在不同时间段向探针板中加入寡酶素（oligomycin）、解偶联剂碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙（carbonylcyanide-4-trifluoromethoxyphenylhydrazone，FCCP）、鱼藤酮&抗霉素A（rotenone & antimycin A）等药物，从而分析线粒体氧化呼吸能力的大小，实验方法参考已发表的文献［19］。

2.3 Western blot 检测骨骼肌纤维相关蛋白的表达 采集小鼠腓肠肌组织，剪碎制备成组织匀浆。使用RIPA 裂解液裂解组织提取总蛋白。测蛋白浓度后配制10%的SDS-PAGE 凝胶，取20 μg 蛋白质加样，电泳条件50 V，30 min；80 V，30 min；120 V，30 min；使用 PVDF 膜转膜，条件为 400 mA，30 min。TBST 洗膜3 次，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h。加Ⅰ抗（Myh7、Myh2、Myh4 和 α-tubulin）稀释液4 ℃孵育过夜，洗膜后加Ⅱ抗稀释液室温孵育1 h。使用蛋白成像系统进行曝光并定量分析。

3 统计学处理

所有数据均采用GraphPad Prism 8.0 进行独立样本t检验，数据以均数±标准差（mean±SD）表示，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 Ogt敲除对小鼠骨骼肌纤维组成的影响

免疫荧光染色结果表明，与WT 组相比，Ogt-/-小鼠I 型肌纤维显著增多，II 型肌纤维显著减少，见图1。

2 Ogt 敲除对小鼠骨骼肌线粒体氧化呼吸能力的影响

用Seahorse XFe24能量代谢分析仪检测OCR，结果表明，与WT 小鼠相比，Ogt-/-小鼠中由oligomycin、FCCP 及rotenone & antimycin A 刺激引起的线粒体OCR 均降低，骨骼肌线粒体的基础有氧呼吸、ATP 合成、有氧呼吸最大值及非线粒体呼吸对比WT组均显著降低（P＜0.01），见图2。

Figure 1. The fiber composition of skeletal muscle was detected by immunofluorescen. The scale bar=20 μm.图1 免疫荧光检测骨骼肌纤维组成

Figure 2. Seahorse assayed mitochondrial oxidative respiration in skeletal muscle. A：oxygen consumption rates（OCR）of skeletal muscle in mice；B：analysis of basal respiration，ATP production，maxmal respiration and spare respiratory capacity.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs WT group.图2 Seahorse检测骨骼肌线粒体氧化呼吸能力

3 Ogt敲除对小鼠骨骼肌纤维相关蛋白表达的影响

为了检测Ogt敲除是否会影响肌肉纤维的转化，我们检测了小鼠骨骼肌纤维Myh2、Myh4 和Myh7 蛋白的表达，Western blot 结果显示，Ogt敲除显著上调了小鼠骨骼肌中 Myh7 的蛋白表达（P＜0.05），而Myh2 蛋白的表达显著下调（P＜0.05），同时Myh4 蛋白有降低的趋势，但与WT 组差异没有统计学意义，见图3。

讨 论

O-GlcNAc 糖基化修饰是一种常见的糖基化形式，它可以调节细胞质基质、细胞核和线粒体内的蛋白质，而线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，线粒体动力学可以调节细胞能量、响应细胞信号、维持细胞器的平衡。

有研究指出Ogt基因骨骼肌特异性敲除小鼠骨骼肌质量显著下降，同时线粒体数量增加［16］。因此，本实验旨在研究O-GlcNAc 糖基化修饰对小鼠骨骼肌纤维的影响，探讨肌纤维类型的变化。实验结果表明，Ogt敲除小鼠骨骼肌线粒体的OCR 降低，从而影响了线粒体生物发生过程。Akinbiyi 等［20］观察到Oga敲除增强细胞O-GlcNAc糖基化的同时会增加线粒体裂变，线粒体的形态变小、线粒体含量增加，虽然氧化磷酸化基本不受影响，但细胞呼吸和ATP 水平略有升高。另有研究证明［21］Oga敲低增加了骨骼肌分化过程中的基础呼吸、最大呼吸和ATP 水平。而O-GlcNAc 糖基化修饰的整个过程只由OGT 和OGA 两个酶之间的动态循环进行调控［22］。因此，我们推测Ogt敲除会降低线粒体生物发生，细胞呼吸和ATP 水平也会有所降低，本实验也证明了这一推测，Seahorse 检测结果显示Ogt敲除的小鼠骨骼肌线粒体OCR 和ATP 生成均发生显著性降低。我们认为O-GlcNAc 糖基化循环改变，使线粒体功能受损，具体来说，O-GlcNAc 糖基化减少使线粒体骨骼肌的呼吸能力受损，呼吸链受到损伤，可能导致氧化应激的发生，并且累积对线粒体DNA 的损伤，长期暴露于这种情况下，可能会引起线粒体动力学失衡，从而导致肿瘤［23］、肥胖［24］和各种神经系统疾病的发生。

Figure 3. Western blot was used to detect the protein expression of Myh2，Myh4 and Myh7 in skeletal muscle fibers. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs WT group.图3 Western blot检测骨骼肌纤维Myh2、Myh4和Myh7蛋白的表达

Ahn等［25］的研究表明PRDX3的肌肉特异性过表达减少了线粒体过氧化氢的释放，并防止了Sod1 敲除肌肉中线粒体电子传递链活性和钙保留能力的丧失，改善了收缩功能障碍和肌肉萎缩，且肌纤维数量和质量减少的现象也得到缓解。Shi 等［16］对小鼠骨骼肌纤维相关蛋白进行检测，结果表明在Ogt敲除的肌肉中，Myh7基因表达显著上调，Myh1基因表达下调，与本试实验蛋白表达结果一致，均呈现出II 型向I型转化的现象，同时，本实验还显示Ogt敲除后影响了小鼠骨骼肌的线粒体生物发生，但是O-GlcNAc 是通过何种途径以及何种机制影响了骨骼肌纤维以及线粒体的变化仍需进一步研究。

综上所述，本实验研究结果表明，O-GlcNAc 糖基化循环失衡会使小鼠骨骼肌线粒体功能受损，Ogt敲除能够显著降低骨骼肌线粒体的生物发生，使线粒体功能失调，从而使氧化磷酸化产生的ATP 减少，ROS 生成增加，导致骨骼肌纤维类型转化，为后续深入研究O-GlcNAc 糖基化修饰在骨骼肌发育中的作用提供了参考资料。