和厚朴酚通过调节自噬对帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元的影响及机制*

张 申， 陈 坤， 赵丹鹏， 张红霞， 徐国卫△

（1郑州大学附属郑州中心医院神经电生理科，河南 郑州 450000；2郑州大学附属郑州中心医院神经内科，河南 郑州 450000）

帕金森病是一种神经退行性疾病，多发于老年人群，其典型临床症状包括肌肉僵直、静止性震颤、运动迟缓和姿势反射障碍等，其主要神经病理学特征为脑黑质多巴胺能神经元变性、丢失［1-2］。近年来，帕金森病发病率不断上升，但目前的治疗手段只能部分缓解疾病症状，缺乏足够有效、成熟的药物阻止或逆转帕金森病情进展［3］。因此，寻找有效的药物减少脑黑质多巴胺能神经元丢失，仍是帕金森病治疗的重要挑战。和厚朴酚是中药厚朴中的主要生物活性成分之一，具有抗炎、抗菌、抗氧化等多重效用［4］。研究发现，和厚朴酚能减轻神经细胞损伤，具有发展为抗神经系统疾病药物的潜力［5］。相关研究发现，退行性疾病的发生与自噬缺陷有关，诱导自噬能减少帕金森病小鼠黑质多巴胺能神经元的丢失、凋亡［6-7］。而和厚朴酚在肺癌中被发现能诱导肺癌A549 细胞自噬，但其对抗帕金森病模型小鼠神经损伤的机制是否涉及自噬尚不清楚［8-9］。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）通路是常见的自噬通路［10］。基于此，本研究将探讨和厚朴酚调控自噬通路对帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元的影响。

材料和方法

1 动物

雄性C57BL/6小鼠共80只，10周龄，购自河南省实验动物中心，许可证号为SCXK（豫）2017-0001。饲养条件：室温（24～26）℃，湿度45%～55%，自由饮食进水，昼夜12 h交替循环。

2 主要试剂与仪器

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）购自Med-ChemExpress；和厚朴酚购自上海宝曼生物科技有限公司；氯喹购自TargetMol；TUNEL 试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司；beclin-1 免疫组化染色试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗p-AMPK、兔抗AMPK、兔抗SIRT1、兔抗beclin-1、兔抗Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、兔抗胱天蛋白酶3（caspase-3）、兔抗GAPDH 和山羊抗兔Ⅱ抗均购自Abcam；兔抗微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）购自北京博奥森生物科技有限公司。SA102型Rotarod疲劳转棒仪购自江苏赛昂斯生物科技有限公司；DM3000型荧光显微镜购自Leica；Ti-S型显微镜购自Nikon；GS-800型凝胶扫描成像系统购自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 帕金森病小鼠模型制备 采用MPTP注射法建立帕金森病小鼠模型。用生理盐水将MPTP 稀释为1 g/L，向小鼠腹腔注射30 mg/kg，每日1次，连续注射7 d，观察到小鼠自发性活动减少，爬行、逃避反应减慢，静息时全身明显震颤，表明帕金森病小鼠模型构建成功。

3.2 实验分组及实验给药 将本实验模型构建成功的64 只小鼠分为模型组、低剂量和厚朴酚组、高剂量和厚朴酚组及自噬抑制组，每组16 只，另取同期连续腹腔注射7 d 等体积生理盐水的16 只小鼠为对照组。低、高剂量和厚朴酚组小鼠分别灌胃20 和60 mg/kg 和厚朴酚（用乙醇溶解后，用生理盐水分别配制成 2 和 6 g/L，分别灌胃 10 mL/kg）［9］，自噬抑制组小鼠灌胃60 mg/kg 和厚朴酚和20 mg/kg 氯喹（用生理盐水分别配制成2 g/L，灌胃10 mL/kg），对照组及模型组小鼠均灌胃等体积生理盐水（灌胃10 mL/kg），连续灌胃14 d，每日1次。

3.3 小鼠行为学功能测试 末次给药后，采用转棒实验及爬杆实验测试所有小鼠的行为学功能。转棒实验：小鼠置于疲劳转棒仪的30 mm 转棒上，设置转速为30 r/min，记录从转棒开始旋转到小鼠掉落的时间（跌落潜伏期），每只小鼠连测3 次，每次间隔1 min，取3 次结果的均值为最终结果，所有小鼠在正式测试之前适应性测试3 次。爬杆实验：长50 cm、直径1 cm 的木杆上端固定直径25 cm 的软木球，木杆上缠纱布防滑，将小鼠置于软木球上，记录小鼠爬至杆底所需时间（爬杆时间），所有小鼠在正式测试之前引导自杆顶爬下至杆底3次。

3.4 TUNEL 染色检测黑质神经元凋亡 进行行为学功能测试后，每组取8 只小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉断头处死，分离脑部黑质，甲醛固定、乙醇脱水、透明后石蜡包埋、切片。黑质石蜡切片经烤片、脱蜡、水化等处理后，滴加不含DNase 的蛋白酶K，并在37 ℃下作用15 min，PBS 洗涤。于冰上制备TUNEL反应混合液，滴加在标本上50 μL，于暗湿盒中37 ℃反应1 h，PBS 洗涤，用含DAPI 的抗荧光淬灭封片液封片，在荧光显微镜下观察，计算细胞凋亡率。

3.5 免疫组化染色检测黑质中beclin-1表达 黑质石蜡切片经烤片、脱蜡、水化等常规操作脱蜡至水，用 0.2%Triton X-100 室温孵育 10 min，用 3%H2O2溶液室温下孵育10 min，浸入枸橼酸钠缓冲溶液中用微波炉加热修复抗原，常温冷却，用5%脱脂奶粉室温孵育0.5 h，加入I抗（兔抗beclin-1）4 ℃孵育过夜，加入II抗（羊抗兔IgG）室温孵育0.5 h，滴加SABC 室温反应20 min，DAB 显色，苏木精复染，中性树胶封片，显微镜观察，低倍镜下选beclin-1 阳性细胞密集区，高倍镜下选5 个视野进行阳性细胞计数，取均值。

3.6 Western blot 法检测黑质中AMPK/SIRT1 自噬通路及凋亡相关蛋白表达 每组剩余8只小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉，断头处死，分离脑部黑质，于冰上加入含磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，置于摇床上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心30 min 分离上清，BCA 法测定总蛋白浓度。各个蛋白标本取40 μg，采用SDS-PAGE分离蛋白，结束后将目标蛋白转印至PVDF 膜上，放在5%脱脂奶粉中室温封闭1 h，分别放入不同I 抗（兔抗AMPK、兔抗p-AMPK、兔抗 SIRT1、兔抗 LC3、兔抗 beclin-1、兔抗Bax、兔抗 caspase-3 和兔抗 GAPDH）孵育液（均 1∶1 200稀释）中4℃孵育过夜，PBS洗膜，放入山羊抗兔Ⅱ抗孵育液（1∶2 000 稀释）中室温孵育1 h，PBS 洗膜，加ECL 发光液显色，在凝胶成像系统中扫描图像，用ImageJ软件分析图像中各条带灰度。

4 统计学处理

本研究数据以均数±标准差（mean±SD）表示，使用GraphPad 软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠行为学功能

与对照组相比，模型组小鼠的跌落潜伏期显著缩短，爬杆时间显著延长（P＜0.05）；与模型组相比，低、高剂量和厚朴酚组小鼠的跌落潜伏期显著延长，爬杆时间显著缩短（P＜0.05）；随着和厚朴酚剂量的升高，小鼠的跌落潜伏期延长，爬杆时间缩短（P＜0.05）；与高剂量和厚朴酚组相比，自噬抑制组小鼠的跌落潜伏期显著缩短，爬杆时间显著延长（P＜0.05），见图1。

2 各组小鼠黑质神经元凋亡情况

与对照组相比，模型组小鼠黑质神经元凋亡率显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，低、高剂量和厚朴酚组小鼠黑质神经元凋亡率显著降低（P＜0.05）；随着和厚朴酚剂量的升高，小鼠黑质神经元凋亡率降低（P＜0.05）；与酚高剂量和厚朴酚组相比，自噬抑制组小鼠黑质神经元凋亡率显著升高（P＜0.05），见图2。

3 各组小鼠黑质中beclin-1表达差异

与对照组相比，模型组小鼠黑质中beclin-1 阳性细胞数显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，低、高剂量和厚朴酚组小鼠黑质中beclin-1 阳性细胞数显著升高（P＜0.05）；随着和厚朴酚剂量的升高，小鼠黑质中beclin-1阳性细胞数升高（P＜0.05）；与高剂量和厚朴酚组相比，自噬抑制组小鼠黑质中beclin-1阳性细胞数显著降低（P＜0.05），见图3。

4 各组小鼠黑质中AMPK/SIRT1 自噬通路相关蛋白表达情况

与对照组相比，模型组小鼠黑质中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和beclin-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，低、高剂量和厚朴酚组小鼠黑质中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和beclin-1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；随着和厚朴酚剂量的升高，小鼠黑质中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和beclin-1蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与高剂量和厚朴酚组相比，自噬抑制组小鼠黑质中 p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I和 beclin-1 蛋白表达水平 显 著 降 低（P＜0.05），见图4。

Figure 1. Fall latency（A）and pole climbing time（B）of the mice in each group. Mean±SD. n=16.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.图1 各组小鼠跌落潜伏期和爬杆时间

5 各组小鼠黑质中凋亡相关蛋白表达情况

与对照组相比，模型组小鼠黑质中Bax 和caspase-3 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，低、高剂量和厚朴酚组小鼠黑质中Bax 和caspase-3 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；随着和厚朴酚剂量的升高，小鼠黑质中Bax 和caspase-3 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与高剂量和厚朴酚组相比，自噬抑制组小鼠黑质中Bax 和caspase-3 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），见图5。

讨 论

Figure 3. The positive expression of beclin-1 in nigral neurons of the mice in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.图3 各组小鼠黑质中beclin-1阳性表达情况

帕金森病是全球仅次于阿尔茨海默病的神经退行性疾病，影响约1%的60 岁以上人群的健康［11］。帕金森病的发生可导致患者生活不能自理，严重降低生活质量，还会引起多种并发症，然而目前无法根治［12］。因此，探索更有效的药物改善帕金森病症状并明确其相关调控机制具有重要意义。脑黑质多巴胺能神经元丢失是帕金森病最主要的病理改变，目前研究通常通过使用神经毒素特异性损伤脑黑质多巴胺能神经元，模拟相应病理改变，构建帕金森病动物模型［13］。本研究使用可透过血脑屏障的神经毒素MPTP 构建帕金森病小鼠模型，可见小鼠的跌落潜伏期显著缩短，爬杆时间显著延长，表明小鼠姿势调整及平衡协调能力减弱，在行为学上已出现运动迟缓及姿势协调障碍，帕金森病造模成功。同时，MPTP诱导建模后，小鼠黑质神经元凋亡率及凋亡蛋白Bax和caspase-3 水平显著升高，表明MPTP 已损伤小鼠的脑黑质，导致多巴胺能神经元丢失。

和厚朴酚是中药厚朴中最主要的两个活性成分之一，具有广泛的药理作用，如抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤及保护心脑血管等，对中枢神经系统的影响尤其显著，已被发现具有抗抑郁、抗癫痫、抗焦虑、抗凝血、抗老年痴呆及抗帕金森病神经损伤等作用［14］。徐莹等［9］发现，和厚朴酚能增加帕金森病小鼠的自主活动次数及脑内多巴胺含量，具有神经保护作用。Chen 等［15］发现，和厚朴酚能激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ，缓解偏侧帕金森病小鼠的运动功能障碍。本研究显示，使用和厚朴酚治疗后，帕金森病小鼠的跌落潜伏期显著延长，爬杆时间显著缩短，同时小鼠黑质神经元凋亡率及Bax 和caspase-3 蛋白水平逐渐降低，且和厚朴酚剂量越高，效果越明显，表明和厚朴酚可抑制帕金森病小鼠黑质神经元凋亡，减轻行为学障碍，但其降低黑质神经元凋亡的机制还需进一步研究。

自噬，又称作Ⅱ型程序性细胞死亡，在细胞生长发育及细胞内环境稳定调节过程中起重要作用，目前普遍被认为是一种防御、应激调控机制，在细胞应激条件下，可将损伤细胞器、错误蛋白再利用，避免更多细胞损伤、凋亡［16］。大量研究发现，帕金森病等退行性疾病的发生伴随自噬缺陷，自噬的减弱很可能是退行性疾病患者神经元不断凋亡的重要因素［17-18］。本研究亦显示，帕金森病小鼠黑质中自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I 和beclin-1 水平显著降低，黑质中beclin-1阳性细胞数亦显著降低，表明帕金森病发生后，能发生自噬反应的黑质神经元减少，黑质中自噬反应减弱。

Figure 4. The protein levels of p-AMPK，AMPK，SIRT1，LC3-I，LC3-II and beclin-1 in nigral neurons of the mice in each group.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.图4 各组小鼠黑质中p-AMPK、AMPK、SIRT1、LC3-I、LC3-II和beclin-1蛋白水平

Figure 5. Expression of Bax and caspase-3 proteins in nigral neurons of the mice in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs low-dose honokiol group；▲P＜0.05 vs high-dose honokiol group.图5 各组小鼠黑质中Bax和caspase-3蛋白表达情况

AMPK/SIRT1是调控自噬的上游信号通路，自噬过程中，AMPK 发生磷酸化并激活SIRT1，导致下游beclin-1表达增加，LC3由LC3-I向LC3-II转化［19］。本研究显示，MPTP 诱导建模后，小鼠黑质中p-AMPK/AMPK、SIRT1 蛋白表达水平降低，表明帕金森病发生时，AMPK/SIRT1介导的自噬途径受到抑制。有研究发现，和厚朴酚能激活SIRT1/FOXO1信号通路，抑制脓毒症脑损伤小鼠脑组织细胞凋亡［20］。陈兰等［21］研究显示，和厚朴酚能激活Sirt3/AMPK 途径，抑制肺微血管内皮凋亡。本研究使用和厚朴酚治疗后，帕金森病小鼠黑质中p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和beclin-1 蛋白表达水平及beclin-1 阳性细胞数均显著升高，表明和厚朴酚可激活AMPK/SIRT1介导的自噬途径，恢复自噬反应，提高发生自噬反应的黑质神经元数量。使用和厚朴酚治疗的同时使用氯喹抑制自噬反应，结果可见，小鼠的跌落潜伏期显著缩短，爬杆时间显著延长，黑质中beclin-1 阳性细胞数及 p-AMPK/AMPK、SIRT1、LC3-II/LC3-I 和 beclin-1 蛋白表达水平显著降低，黑质神经元凋亡率及Bax 和caspase-3 蛋白表达水平显著升高。这些结果表明，和厚朴酚抑制帕金森病小鼠黑质多巴胺能神经元凋亡的机制与激活AMPK/SIRT1 通路介导的自噬反应有关。

综上所述，和厚朴酚能激活自噬反应，活化AMPK/SIRT1通路，抑制帕金森病小鼠黑质多巴胺能神经元凋亡，改善其行为学功能，可为临床改善帕金森病症状提供参考资料。