荷斯坦牛冷冻胚胎移植受孕率影响因素分析

高留涛，李鹏涛，衡军材，吕博博，王志丹，汪聪勇

（河南省鼎元种牛育种有限公司，郑州 450046）

20世纪70年代以来，随着胚胎移植技术水平的不断提高，胚胎移植已成为奶牛生产中广泛应用的辅助生殖手段。胚胎移植是实现高遗传水平个体快速扩繁的重要手段，可以充分发挥公母畜的遗传优势，对于牧场的牛群品种改良或扩繁优质基因具有重大意义。通过胚胎移植，可以快速培育优秀的种公、母牛。而胚胎移植后妊娠成功率的提高受多种因素的影响，如收集胚胎时的温湿度、胚胎质量、受体牛发情周期、子宫疾病、胎次和胚胎类型等[1,2]。利用荷斯坦牛冷冻胚胎进行胚胎移植开展种公牛培育是目前国内种公牛培育的重要途径，可以有效降低种牛培育成本，避免疫病等风险。近年来，开展胚胎移植效果的研究内容很多，本文主要研究了受体牛发情类型、受体牛利用次数、黄体类型、不同操作人员和受体牛月龄等方面对胚胎移植后受孕率的影响，以期为优化胚胎移植技术、提高荷斯坦牛冷冻胚胎移植成功率提供技术理论及实践依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源

本试验中的数据来源于河南省某育种公司于2021年1-3月份在山东某奶牛养殖场进行冷冻胚胎移植研究的资料，共收集了931条胚胎移植数据统计分析，数据主要包括受体牛只发情类型、受体牛只利用次数、移植时间、黄体位置、黄体类型及孕检情况等。

1.2 胚胎及受体牛

胚胎来源于美国进口顶级胚胎。受体牛来源于山东某奶牛养殖场，为24月龄以下的青年荷斯坦牛，健康无疾病且发育正常。

1.3 胚胎移植过程

1.3.1 移植时间

在受体母牛发情后（发情当天为第0天）第7天（6～8d）用非手术法进行胚胎移植。

1.3.2 胚胎解冻

用水浴解冻方法对冷冻胚胎进行解冻。从液氮罐中取出装有胚胎的0.25mL塑料细管，在空气中停留3～5s，然后放入30℃的水杯中，40s后取出，用纸巾擦干。

1.3.3 胚胎移植过程

采用非手术法进行胚胎移植：①对照供体牛采胚记录表和合格受体牛的发情记录，合理搭配受体和胚胎；受体牛在发情后6～8d之间均可进行胚胎移植。②受体牛实行1～2尾椎间硬外膜麻醉，擦拭外阴部。③解冻胚胎，用乙二醇为冷冻剂生产的胚胎可直接进行解冻移植，不需要重新装管。④细管装入移植枪内。⑤把装有细管的移植枪套上硬外套，用塑料环卡紧，再套上软外套。⑥将胚胎移植到受体牛有黄体一侧子宫角上1/3～1/2处。⑦做好受体牛移植记录。

1.3.4 妊娠诊断

用直肠检查法进行妊娠诊断。在胚胎移植后60d用直肠触摸的方法对移植受体牛进行检查，判断是否妊娠。

1.4 统计分析

使用Excel对数据进行整理，各处理组的受孕率差异采用卡方检验进行分析，当期望计数＜5时，采用费希尔精确检验。P＜0.05时表示差异显著，0.05＜P＜0.1时表示有差异趋势。

2 结果与分析

2.1 发情类型对于冷冻胚胎移植受孕率的影响

由表1可知，自然发情和同期发情奶牛的移植受孕率差异不显著（P＞0.05）。

表1 发情类型对受孕率的影响

2.2 受体牛只利用次数对于冷冻胚胎移植受孕率的影响

由表2可知，移植次数对受胎率无显著影响（P＞0.05）。

表2 移植次数对受胎率的影响

2.3 操作人员对于冷冻胚胎移植受孕率的影响

由表3可知，人员C的胚胎移植受孕率显著低于人员A和B（P＜0.05），而人员D的移植受孕率与其他各组差异不显著（P＞0.05）。

表3 移植人员对受胎率的影响

2.4 黄体类型对于冷冻胚胎移植受孕率的影响

由表4可知，1级黄体的移植受孕率要显著高于3级黄体和4级黄体（P＜0.05），2级黄体的移植受孕率与其他各组差异不显著（P＞0.05）。二级黄体受孕率有小于一级黄体受孕率的趋势（0.05＜P＜0.1），但也有大于三级黄体受孕率的趋势（0.05＜P＜0.1）。

表4 黄体类型对受胎率的影响

2.5 受体牛月龄对于冷冻胚胎移植受孕率的影响

由表5可知，20～21月龄牛的移植受孕率显著大于16～17月龄（P＜0.05）。18～19月龄牛胚胎移植受孕率与其他两组无显著差异（P＞0.05），但20～21月龄受孕率有大于18～19月龄受孕率的趋势（0.05＜P＜0.1）。

表5 受体牛月龄对受孕率的影响

3 讨论

3.1 受体牛发情类型及利用次数对于胚胎移植受胎率的影响

在本研究中，受体母牛发情类型对于胚胎移植后受胎率没有显著影响，使用的同期药物在引发母牛情期开始上与自然发情效果一致。Sugiura等[3]研究发现，在奶牛排卵前60～12h，诱导发情奶牛的子宫内膜厚度要显著大于自然发情奶牛。而哺乳动物的子宫内膜对妊娠的形成和维持至关重要，子宫内膜过薄或过厚均与动物的生育能力相关[4,5]。这也可能是同期药物处理的奶牛胚胎移植受胎率略高于自然发情奶牛的原因。但在总体受孕率上，同期发情较自然发情在使用效果上差异不明显，因此在实际生产中可以加以推广使用验证。虽然受体母牛利用一次和两次的受胎率无显著差异，但是利用一次的受体牛受胎率要高于利用两次的受体牛。Irikura等[6]研究发现，随着人工输精次数的增加，日本黑牛从第一次输精受孕率51.4%降低到第四次及以上输精受胎率29.6%。而侯荩褒等[7]同样发现，二次配种受孕率较一次配种受孕率减低6个百分点，与本试验研究所得结果一致。

3.2 操作人员对于胚胎移植受胎率的影响

在本研究中，不同移植操作人员的胚胎移植受孕率有所不同，人员A和B的移植受孕率显著高于人员C。邹阿玲等[8]统计发现，不同操作人员的胚胎移植受胎率最高可达67.1%，最低为37.5%，差异极显著，这与张震等[9]的研究相一致。不同操作人员的手法、操作细腻程度对受体母牛的损伤及造成的应激不同，专业操作能力强的技术人员能够对受体母牛子宫环境做出准确判断，降低移植过程中受体牛的应激程度，因此整体胚胎移植受胎率较高。相反，初学者对于胚胎移植位置把握不准确，操作手法粗放，牛只应激强烈，都会导致受胎率降低。胚胎移植工作大面积推广，需要有专业人员的指导，技术操作人员应善于总结，才能培养出优秀的胚胎移植技术操作人员。

3.3 黄体类型对于胚胎移植受胎率的影响

胚胎移植的成功不仅与高质量胚胎和良好的子宫环境相关，还与受体母牛黄体形态及大小相关。黄体大小及形态对胚胎移植受胎率的研究较多，据桑润滋[10]报道，受体牛黄体直径越大，移植受胎率越高，这和协超等[11]的研究结果一致，但王建国[12]的研究发现黄体直径大小与胚胎移植受胎率无显著影响。本试验根据受检时黄体大小及形态特征对黄体进行分类，发现各种类型的黄体受孕结果不同。其中，黄体组织大小对胚胎移植受胎率无明显影响，这与Thomson等[13]的研究结果一致。而黄体形态对于移植受胎率产生显著影响，形态呈圆锥状、顶端发育明显的黄体较呈蘑菇状、顶端平整的黄体受孕率更高。

3.4 受体母牛月龄对于胚胎移植受胎率的影响

动物年龄对其繁殖性能有着至关重要的影响。从本研究结果来看，在一定时间段内，随着胚胎移植受体母牛月龄的增长，胚胎移植受胎率相应在提高。研究发现2～6周岁受体牛的受孕率高于2周岁以内的青年受体牛[14]和7岁以上的受体牛[15]。同样地，陈江凌发现，13～18月龄的受体牛胚胎移植后流产率明显高于19～23月龄[16]。由此可见，随着受体母牛月龄的增长，其生殖系统发育成熟，机体内环境逐渐稳定，有利于胚胎的着床受孕。而年龄过大的受体母牛因其繁殖力降低，子宫疾病易发等原因可能造成胚胎移植后受孕率降低。

4 结论

本研究结果表明，在荷斯坦牛冷冻胚胎移植过程中，受体母牛的发情类型和移植次数未对移植后受孕率产生显著影响；操作能力强的技术人员能够提高胚胎移植母牛的受孕率；一级黄体的移植受孕率显著高于其他类型的黄体；胚胎移植受体母牛的受孕率随母牛年龄的增长而提高。