基于GC-MS和网络药理学探讨当归-肉桂药对的抗炎作用机制

曾格格，刘毅，刘天琪，黄振阳，丁晨薇

（湖北中医药大学药学院/湖北省药用植物研发中心，武汉 430065）

按照中药配伍“相须、相使、相畏、相杀、相恶、相反”的原理，体现四气五味、升降浮沉、归经等中药药性理论，药对已经成为现代中医临床常用的配伍组合［1］。中药当归（Angelica sinensisRadix）来源于伞形科植物当归（Angelica sinensis（Oliv.）Diels）的干燥根，当归甘、辛、温，归肝、心、脾经。现代药理学研究发现，当归不仅养血活血，其有效成分当归多糖、藁本内酯还具有抗炎、抗血小板凝集以及抗氧化等药理作用［2］。中药肉桂（Cinnamomi cortex）来源于樟科植物肉桂（Cinnamomum cassiaPresl）的干燥树皮。肉桂辛、甘、大热，归肾、脾、心、肝经。肉桂中所含的肉桂醛等成分具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗寄生虫等药理作用。现代研究证实，当归、肉桂合用可以扩张周围血管，改善微循环，增加局部血液循环，促进炎症吸收和局部消肿作用［3］。炎症作为一种保护性免疫反应，炎症反应不足会导致病原体持续感染，而过度炎症则导致慢性或系统性炎症性疾病［4］。许多疾病的本质均为炎症反应。因此，挖掘新型抗炎药物对于解决炎症性疾病具有重要作用。在《景岳全书》《备急千金要方》等相关著作中，当归-肉桂作为药对制备出的各种复方制剂，常用于治疗月经不调、寒湿痹痛、肌肤麻木及关节不利等症［5］，疗效显著，但目前关于当归-肉桂药对抗炎活性成分相关研究较为鲜见。因此，本研究采用GC-MS（气相色谱-质谱）对当归、肉桂及其药对进行比较分析，再借助网络药理学筛选出抗炎主要活性成分、关键靶点及潜在信号通路，从系统生物学角度探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器手动固相微萃取（SPME型）进样装置，德国IKA公司；气相-质谱-计算机联用仪（Agilent 6890/5973型），美国Hewlett-Packard公司；顶空瓶（15 mL）；65 μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取纤维头，美国Supelco公司；电子天平（ALC-210.2型），北京赛多利斯天平有限公司。1.1.2药材当归、肉桂药材均购于湖北辰美中药有限公司，经湖北中医药大学药学院生药教研室鉴定，分别为伞形科植物当归的干燥根及樟科植物肉桂的干燥树皮。

1.1.3 药材的前处理将当归、肉桂药材分别用粉碎机打成粉末并过16目筛，取出备用。

1.2 方法

1.2.1 GC-MS色谱与质谱条件

1）GC条件。色谱条件HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：从50℃开始，以10℃/min升温至230℃，保留3 min；载气：高纯度He（99.999%），柱流速：0.8 mL/min，进样口温度：230℃。

2）MS条件。EI源；离子源温度230℃，电离能70 eV；四级杆温度150℃；扫描质量范围35˜ 550m/z。

1.2.2 顶空固相微萃取条件将当归-肉桂药对粗粉混合，以萃取吸附量多少、能否达到最佳萃取效果、总峰面积尽可能大作为参考要求。将样品量、萃取温度、萃取以及解析时间分别进行单因素考察。最终确定GC-MS的最佳条件：精密称取当归-肉桂药对粉末0.6 g（当归、肉桂各0.3 g），置于15 mL顶空瓶中，插入装有65 μm PDMS/DVB型萃取纤维头的手动进样器，100℃预平衡20 min，再伸出萃取头顶空萃取15 min，取出后立即插入色谱仪进样口（温度230℃），解吸3 min。

1.2.3 网络药理学研究

1）成分数据收集与获取。将当归-肉桂药对挥发性成分CAS号输入中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）［6］搜索栏进行检索，获取化合物的相关靶点信息。并在Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）［7］搜索栏输入成分的CAS号，得到其分子结构，并保存为Canonical SMILES格式。将下载的SMILES格式文件导入Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）［8］，选定研究物种为“Homo sapiens”，得到成分的对应靶点，整合TCMSP和Swiss Target Prediction靶点结果，删去重复的作用靶点，得到组分潜在作用靶点。

2）疾病靶点获取。搜索GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）［9］和TTD数据库（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）［10］，以inflammation为关键词进行检索，获得作用靶点，将上述数据库所获取的靶点，删除重复值后进行合并。

3）潜在作用靶点获取。使用UniProt蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org）［11］将疾病靶点与药物成分的潜在靶点统一规范为Gene Symbol，其后将化合物、疾病的靶点录入Venny 2.1.0软件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线作图工具平台，绘制韦恩图，得到两者交集（即共同靶标），作为潜在作用靶点。

将TCMSP和Swiss Target Prediction数据库收集的潜在作用靶点及其对应成分分别导入Cytoscape 3.7.2软件［12］，构建“药物-成分-靶点”网络图，使用Network Analyzer功能对网络进行分析，根据节点Degree、Betweenness、Closeness筛选出其抗炎的主要活性成分。

1.2.4 PPI网络构建及分析将疾病与药物的交集靶点输入STRING数据库［13］获取靶标蛋白互作网络关系，构建蛋白相互作用网络模型，设置minimum required interaction score为0.4，删除孤立点；获得蛋白相互作用信息，并将其导入Cytoscape 3.7.2软件，构建PPI网络并进行拓扑指标分析，筛选出关键靶点。

1.2.5 富 集 分 析利 用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包（Bioconductor）［14］对疾病与药物的交集靶点进行生物信息富集分析，包括GO分析以及KEGG通路分析。

2 结果与分析

2.1 当归-肉桂药对挥发性成分分析

通过选定的萃取条件对当归-肉桂药对进行试验，得到当归-肉桂药对GC-MS总离子流。通过质谱数据库检索及文献比对，从当归-肉桂药对中共检测出51个峰（图1），初步鉴定出35种成分，占总挥发性成分的70.53%。其中，挥发性成分含量较高的有α-蒎烯（29.80%）、Δ-杜松烯（8.59%）、（3E）-3，7-二甲基辛-1，3，6-三烯（7.97%）、（-）-菖蒲烯（6.64%）、β-榄香烯（4.17%）、β-石竹烯（2.87%）、α-律草烯（2.42%）等（表1）。

表1 当归-肉桂药对挥发性成分分析结果

图1 当归-肉桂药对挥发性成分的总离子流

2.2 潜在靶点收集

根据药对的CAS号，在TCMSP及Swiss数据库中得到的预测靶点，合并且删掉重复的作用靶点，共得到靶点398个。通过Therapeutic target datebase数据库、GeneCards数据库得到炎症相关基因靶点1 639个，在Venny 2.1.0软件在线作图工具平台上输入成分、疾病的靶点，绘制韦恩图，两者取交集后得到共同靶点184个（图2）。

图2 成分、疾病靶点的韦恩图

2.3 “药物-成分-靶点”网络构建及分析

将化学成分及184个潜在作用靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，进行网络绘制（图3），此网络由219个节点和659条边构成，并通过Network Analyzer对网络图进行分析。结果显示，当归-肉桂药对重要的抗炎活性成分包括α-蒎烯、β-榄香烯、β-石竹烯、α-律草烯、（-）-异洒剔烯、肉桂醛、二正戊基酮、别罗勒烯、苯乙烯、（-）-菖蒲烯、邻甲氧基肉桂醛等，均能与多个靶点相连接。同时，又可共同作用于一些靶点，体现了挥发油多成分、多靶点、多途径的综合调节特点。

图3 药物-成分-靶点网络

2.4 PPI网络构建

在STRING数据库中输入184个潜在作用靶点，得到蛋白相互作用信息，使用Cytoscape 3.7.2软件对上述数据进行可视化分析，构建PPI网络，并对网络进行筛选，以高于介度（Betweeness）、紧密度（Closeness）的中位数且连接度（Degree）大于2倍中位数为标准，筛选出35个关键靶点（表2），其中度值（Degree）最高的为TNF，能与128个蛋白发生相互作用，其 次 是IL-6、IL-1β、AKT1、STAT3、MAPK3、TLR4等，分别能与125、107、104、84、83、79个蛋白发生相互作用。PPI网络见图4，图形颜色越深、图形越大，靶点度值越高，说明其对应的节点在网络中越重要，反之，颜色越浅，节点越小，代表度值越低。

表2 关键靶点信息

图4 当归-肉桂药对蛋白质相互作用网络

2.5 靶点通路分析

利用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包（Bioconductor）对疾病与药物的交集靶点进行GO功能富集分析及KEGG信号通路富集分析。得到1 296个生物学过程（Biological process，BP）、31个细胞组成（Cellular component，CC）、89个分子功能（Molecular function，MF），设定P＜0.05，将每一类按照显著性进行排序，将排在前10的GO富集条目和排在前20的KEGG富集条目通过气泡图的形式进行展示，圆圈大小或线条长度表示富集在GO和KEGG的基因数目，颜色代表富集的显著性。

由图5可知，当归-肉桂药对发挥抗炎作用主要涉及的生物学过程（BP）包括对脂多糖的反应（Re-sponse to lipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（Response to molecule of bacterial origin）、对营养水平的反应（Response to nutrient levels）等；细胞组成富集分析（CC）包括膜筏（Membrane raft），膜微区（Membrane microdomain），膜区（Membrane region）等；分子功能富集分析（MF）包括细胞因子受体结合（Cytokine receptor binding）、血红素结合部位（Cytokine receptor binding）、类固醇结合（Steroid binding）等。

图5 GO功能富集分析

KEGG通路分析结果（图6）显示，当归-肉桂药对发挥抗炎作用排名前20的信号通路，关键通路包括脂质和动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、乙型肝炎（Hepatitis B）、点样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）等，表明挥发油可通过作用于不同的生物过程和通路协同发挥抗炎作用。

图6 KEGG通路富集分析

3 小结与讨论

本研究采用GC-MS对当归-肉桂药对的挥发性成分进行比较分析，从当归-肉桂药对中鉴定出35个成分，占总挥发性成分的70.53%。将药对与炎症潜在作用靶点及其对应成分分别导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-成分-靶点”网络，筛选出其主要的活性成分，发现α-律草烯，α-蒎烯、正丁烯基苯酞、β-石竹烯、β-榄香烯、Δ-杜松烯等挥发性成分，有研究表明其均具有良好的抗炎、抗癌、镇痛等作用，具有较高的保健和医疗应用价值，还具有抗氧化、抗衰老、抗炎、保护心血管、防治肿瘤、改善免疫功能等作用［15-18］。α-蒎烯能抑制大鼠巨噬细胞中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、NO的生成及核转录因子-κB信号通路（NF-κB通路），从而具有抗炎作用［19］；β-石竹烯、β-榄香烯通过对PPARA-RXRA-NCOA2信号轴与PTGS2、PTGS1、IL-6等炎性因子的潜在作用，从而发挥产热、减脂、抗炎作用［20］。PPI网络分析结果表明，从184个潜在作用靶点中筛选出35个关键靶点。当归-肉桂药对主要通过TNF、IL-6、IL-1β、AKT1等炎症因子相互作用协同发挥抗炎作用。肿瘤坏死因子（TNF）［21］在抑制炎症反应之外可以诱发降压以及肾脏利尿排钠反应；IL-6作为一种由T淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等细胞分泌出来的炎性细胞因子，具有较突出的调节细胞增殖及分化、免疫抑制等功能；白细胞介素-1β（IL-1β）作为目前临床工作中第一个被发现的白细胞介素，主要功能在于参与内源性致热源与炎症反应［22］。KEGG通路结果表明，当归-肉桂药对主要通过调节脂质和动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、点样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）、弓形体病（Toxoplasmosis）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、耶尔森菌感染（Yersinia infection）、Toll样受体（Toll-like receptor）、TNF等信号通路发挥抗炎作用。其中，IL-17信号通路被认为可影响mRNA转录，在炎症反应中起关键作用，IL-17是一种强有力的炎症性白细胞介素，能激活其他促炎细胞因子的表达［23］，其主要由辅助性T细胞（Th17细胞）和其他来源产生，包括自然杀伤细胞、肥大细胞和中性粒细胞。TNF信号通路可通过CD14+巨噬细胞共同刺激和激活固有层T淋巴细胞（CD14+细胞膜结合的TNF与固有层T细胞上的TNFR2相互作用）来调节肠道炎症。总之，本研究采用GC-MS对当归-肉桂药对进行分析，并运用网络药理学方法揭示了抗炎活性成分及其作用机制，结果表明，当归-肉桂药对通过多种成分、多靶点共同调控炎症信号通路及炎症疾病通路，影响炎症生物学过程，发挥抗炎作用，从而治疗疾病，为当归-肉桂药对后续研究及临床应用提供理论依据和方向。