猫泛白细胞减少症病毒PCR检测方法的建立

王利霞，扈嘉琪，王 平，邬源泉，田 辉，杨文祥*

（1.湖北省疾病预防控制中心（应用毒理湖北省重点实验室），湖北武汉 430070；2.新疆农业大学，新疆乌鲁木齐 830052；3.武汉科前生物股份有限公司，湖北武汉 430070）

0 引言

猫泛白细胞减少症是由猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus，FPV）引起的一种高度接触性急性传染病，也称猫瘟热、猫细小病毒病，该病在自然条件下可感染猫科、浣熊科和鼬科等家猫、野猫及野生动物包括动物园内如虎、狮、豹、浣熊等动物，患病动物表现为高热、呕吐、腹泻和白细胞明显减少等症状。

FPV属于细小病毒科、细小病毒属，于1928年首次被发现，1935年被正式命名为猫泛白细胞减少症病毒。该病毒传染性极强，可通过粪便、尿液、呕吐物、唾液、鼻涕等进行传播，可垂直传播，亦可通过跳蚤等虫媒传播，可致妊娠母猫流产或畸胎，死亡率高。

猫在分类学上属于动物门、哺乳纲、食肉目、猫科、猫属。猫具有独特的生物学特征，早在19世纪末，就有科学家将猫用于动物实验。目前，广泛应用于生物医学研究领域，尤其是在神经类、心血管类药物、降压物质检验等领域，有着不可替代的地位。《中国药典》规定猫是药品检验——药品降压物质检查实验的唯一实验用动物。

虽然猫被广泛应用于实验，但目前缺乏实验用猫相应国家标准，仅有部分省份制定了地方标准，湖北省在实验用猫标准这一块尚为空白。现在用于实验的猫多来源于农贸市场，遗传背景不清楚，微生物和寄生虫等病原携带情况不明确，猫的质量难以得到有效保障，实验数据准确性、重复性无法保证。

因FPV是侵害猫的重要病原微生物，该病的发病率和死亡率均较高，严重影响猫的健康，本研究旨在建立一种针对FPV的快速高效的PCR检测方法，用于筛选健康的实验用猫，进而保障实验的顺利进行，同时为湖北省实验用猫地方标准制定提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与样品。猫泛白细胞减少症病毒（FPV）、猫疱疹病毒（Feline herpes virus，FHV）、猫冠状病毒（Feline coronavirus virus，FCV）来自武汉科前生物股份有限公司；疑似FPV感染猫临床样品来自华中农业大学动物医院和华星动物医院（武汉大学店）。

1.1.2 主要仪器和试剂。D2000 DNA Marker、2×Taq plus Master Mix（含染料）购自北京兰杰柯科技有限公司；血液基因组DNA提取试剂盒、微量样品基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。PCR 仪、凝胶成像分析系统购自美国 Bio-RAD公司；超微量紫外可见分光光度计购自美国丹诺尔Denovix公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成。根据GenBank上FPV基因组（ID：KP769859.1）的保守序列VP2 基因，使用NCBI在线设计引物，序列为FPV-F：5’-TGGAAAACGGATGGGTGGAAA-3’；FPV-R：5’-TCCATGGAGTTGGTATGGTTGG -3’，目的片段长度为465 bp，引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成。

1.2.2 病毒DNA及样品DNA的提取。FPV、FHV、FCV按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，疑似FPV感染猫临床样品按照微量样品基因组DNA提取试剂盒提取DNA。

1.2.3 PCR检测方法的建立。构建PCR扩增体系25μL：2×Taq plus Master Mix 12.5μL，模板3μl，引物FPV-F和FPV-R（10μm/L）各0.2μl，双蒸水补足25μl。95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段送武汉赛维尔生物科技有限公司测序。

1.2.4 PCR检测方法的优化。以提取的FPV基因组为模板，设置48.0℃，48.8℃，50.3℃，52.6℃，55.4℃，57.6℃，59.1℃，60.0℃共8个退火温度进行PCR反应，确定最佳复性温度。

1.2.5 PCR的敏感性检测。利用超微量紫外可见分光光度计测定提取的FPV基因组浓度，将FPV基因组DNA连续10倍稀释进行PCR扩增，凝胶电泳分析结果，确定PCR反应的敏感性。

1.2.6 PCR的特异性检测。以构建的最佳PCR反应条件对FHV、FPV和FCV进行PCR扩增，凝胶电泳分析结果。

1.2.7 临床样品检测。在华中农业大学动物医院和华星动物医院（武汉大学店）共采集了8份猫的肛拭子样品，临床诊断为疑似FPV感染。按照微量样品基因组DNA提取试剂盒说明书对肛拭子样品进行基因组DNA提取，使用本研究建立的PCR方法进行检测和结果分析。

2 结果

2.1 PCR检测方法的建立

引物FPV-F和FPV-R成功扩增出FPV的VP2基因目的片段，约500bp，与预期基因片段长度相符，见图1。

图1 PCR扩增结果

2.2 PCR产物的鉴定及分析

PCR产物测序结果显示获得有效序列片段442bp，经BLAST分析，与GenBank公布的猫泛白细胞减少症病毒HN39AA株VP2基因序列（ID：MK357738.1）同源性为98%，与设计引物的靶基因序列同源性为97%。

2.3 PCR检测方法的优化

通过设置不同的退火温度，优化PCR的扩增条件，结果如图2 所示，8个退火温度均能够扩增到明显目的带，但是在55.4℃时，目的带的亮度最高，因此确定55℃为最佳退火温度。

图2 PCR检测方法的优化

2.4 PCR的敏感性检测

原始FPV基因组的质量为4.42 ng/μL，经连续10倍稀释后作为模板进行PCR扩增，结果显示PCR的最低检测量为4.42×10-5ng/μL，见图3。

图3 PCR的敏感性检测

2.5 PCR的特异性检测

选择临床上常见的感染猫的FHV、FPV、FCV进行特异性实验，同时设阴、阳性对照。结果显示，仅FPV可以扩增到特异性条带（图4）。

图4 PCR的特异性检测

2.6 临床样品检测

采集8份疑似FPV感染的猫肛拭子样品，提取DNA后，采用本研究建立的PCR检测方法进行检测，结果显示2份样品为FPV阳性（图5）。

图5 临床样品检测

3 结论

猫泛白细胞减少症常表现为白细胞计数严重减少和肠炎伴肠绒毛退化，具有高度传染性，并伴有高发病率和高死亡率。随着猫越来越多地应用到科学研究和药物检测中，增加了猫瘟等传染性疾病传播流行的潜在风险。PCR方法具有敏感、特异、技术成熟等优点，便于在临床使用。

本研究通过优化PCR反应的退火温度，确定最佳反应条件，并对扩增产物进行了测序分析，确定PCR反应可以有效扩增到目的片段。同时对PCR检测方法的敏感性和特异性进行了检测，确定该PCR反应的灵敏度高、特异性好，并进行了初步的临床应用，该方法适用于猫泛白细胞减少症病毒的检测。

目前，标准化的实验动物如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴等，均有相应的国家标准对其微生物和寄生虫检测指标做了规定，但缺乏猫的相应国家标准，我省拟制定实验用猫的相关标准。猫泛白细胞减少症病毒作为对猫健康状况有重大影响的一个病毒，是我省实验用猫需要检测的微生物项目，本研究方法的建立将为地方标准的制定提供技术支撑。