猪圆环病毒3型引起母猪流产病例的诊断与分析

段汝亮

（盐山县农业农村局，河北沧州 061000）

2015年，美国某猪场暴发疫情，导致母猪病死率急剧上升，母猪总体妊娠率降低了0.6%；经调查发现，发病母猪多具有皮炎肾病综合征（PNDS）的症状，之后采用免疫组化与荧光定量PCR技术对母猪进行检测，结果显示，猪圆环病毒2型（PCV2）为阴性；借助基因组测序，最终发现了新型圆环病毒，并将其命名为猪圆环病毒3型（PCV3）[1]。

PCV3具有较高的致病性，单独感染时能够表现出显著症状，与PCV2具有明显区别。将PCV3的基因组结构与其他病毒相比较时，可观察到Cap蛋白氨基酸序列和其他病毒的同源性均小于70%，但PCV3仍属于圆环病毒属成员[2-5]。本试验以某猪场两窝流产胎儿为研究对象，借助病毒检测判断母猪流产的具体原因，以期为PCV3的相关研究和临床防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

母猪流产胎儿两窝，每窝各4头，共8头，直接由猪场送至检验室，排除无关因素干扰。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：基因组病毒测序试剂盒（DNA、RNA）购自Axygen生物公司；胰蛋白胨大豆琼脂、PCR Master Mix购自北京艾德兰生物科技企业；cDNA首链合成试剂盒、DL 2000 DNA Marker均购自塔克拉公司。

主要仪器：RT-PCR恒温荧光检测仪（山东云唐智能科技有限公司）、9 cm TSA平板培养基（青岛海博生物公司）、高速离心式（北京博晖创新公司）、病毒免疫荧光分析仪（杭州奥盛有限公司）；移液管、锥形瓶等玻璃仪器（普兰德实验仪器有限公司）等。

1.3 细菌分离培养

正确使用无菌接种环，从母猪流产胎儿的肾脏、脾脏、脑、肺脏等部位分别取病料，并接种于TSA平板培养基，37℃培养24 h，培养结束后观察细菌生长状况。

1.4 引物设计与合成

试验过程中优先设计出PCV3的检测引物，预期设定PCR扩增核苷酸序列。参考GenBank中登录的PCV3基因组序列（ky778776、kx9661993、ky075989、ef524537），正确使用DNAstar软件实施同源性分析，应用生物学软件Primer premier对PCV3的保守区域设计相关引物[6]。引物序列见表1，其他病毒核酸检测引物均由实验室提供。

表1 引物序列Tab.1 Sequence primer

1.5 病毒检测

1.5.1 病料处理

无菌环境下，灭菌的PBS溶液分别处理流产胎儿的肝脏、脾脏、肺脏以及脑部，充分研磨并保证浆液均匀，悬浮液重复冻融操作3次，12 000 r/min离心5 min，取上清液。

1.5.2 提取DNA/RNA

将已经准备好的组织病料取出，并按照提取的正确说明展开操作。获得DNA后，借助PCR技术予以扩增，并将其放置在冷冻环境下进行保存（-80℃）。针对提取得到的RNA，利用RT-PCR进行处理，于相同环境下保存。

1.5.3 PCR/RT-PCR检测

采用PCR/RT-PCR法检测猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PrV）、猪乙脑病毒（JEV）、猪细小病毒（PPV）、PCV2、PCV3等病原，引物信息见表2。

表2 PCR/RT-PCR反应引物信息Tab.2 PCR/RT-PCR reaction primer information

反应体系：2×San Taq Master Mix 5 μL、P1 1 μL、P2 1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 11 μL。反应条件：95℃5 min、95℃10 s、37℃30 s，共30个循环。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养结果

分离细菌在TSA培养基中培养24 h后未出现菌落。

2.2 PCR/RT-PCR检测结果（见图1、图2）

图1 PCR/RT-PCR检测CSFV、PRRSV、JEV、PrV、PPV结果Fig.1 Result of PCR/RT-PCR detection of CSFV,PRRSV,JEV,PrV,PPV

图2 PCR/RT-PCR检测PCV2、PCV3结果Fig.2 Result of PCR/RT-PCR detection of PCV2 and PCV3

图1中1、2为检测CSFV样品，3、4为阳性、阴性对照；5、6为PRRSV样品，7、8为阳性、阴性对照；9、10为JEV样品，11、12为阳性、阴性对照；13、14为PrV样品，15、16为阳性、阴性对照；17、18为PPV样品，19、20为阳性、阴性对照。图2中1、2为PCV2样品，3、4为阳性、阴性对照；5、6为PCV3样品，7、8为阳性、阴性对照。

由图1、图2可知，送检的两窝母猪流产胎儿中仅PCV3呈阳性。

2.3 序列对比分析结果（见图3）

图3 序列比对分析结果Fig.3 Sequence alignment analysis result

由图3可知，此核苷酸序列与其他PCV3具有较高的同源性，相似度超过98%（集中于98.8%～99.3%）。综上，送检的母猪流产胎儿感染了PCV3。

3 讨论

导致妊娠母猪出现流产症状的因素种类较多，通常机械损伤、机体营养状况、应急反应、安全用药以及患病症状等均可能导致母猪流产[7]。近年来，部分猪场连续出现多头妊娠母猪流产的现象；经过进一步调查发现，流产母猪群体未呈药物中毒的迹象，流产前也未曾表现过大的应激反应，且并未受到机械损伤；因此，可推断为病毒导致的流产现象[8-9]。自2017年起，全世界范围内不同国家的猪群中均出现了母猪流产及死胎的情况，通过深入研究，检测到流产胎儿脑组织、心脏、淋巴等组织器官内出现了新型猪圆环病毒PCV3[10]。本研究中，其他种类的病毒病原检测结果均为阴性，仅有PCV3呈阳性，表明PCV3是导致此次母猪流产的主要原因。

猪圆环病毒（PCV）直径为20～25 nm，属无囊膜的12面体结构，猪圆环病毒1型（PCV1）基因组达到1 759 bp[11]；PCV2分为a型与b型两个亚型，基因组大小存在细微差别，分别为1 767、1 768 bp[12-13]；PCV3基因组大于1型和2型，其中GC水平含量所占比例接近1/2，按照结构特征，主要具备3个开放阅读框（PRF）[14-15]，即ORF1、ORF2及ORF3。ORF1编码的Rep蛋白通常由247个氨基酸构成，ORF2编码Cap蛋白通常包括214个氨基酸，上述氨基酸按照相反方向进行复制。ORF3的复制方向和ORF1相似，启动密码子主要包括TGC与ATG两种类型，各自编码的氨基酸数量分别达到231与117个。同时，PCV3基因组大小也可能发生略微变化，若ORF1与ORF2中间的非编码区氨基酸出现了缺失现象，以第1 224位缺失为代表，最终呈现的PCV基因组的大小为1 999 bp。若在6位与7位核苷酸间凭空插入新的核苷酸，PCV3基因组的大小变为2 001 bp。

PCV通常具备遗传多样性的特点，能够广泛感染宿主，甚至可以实现跨种群间的传播。PCV3与犬圆环病毒存在的进化关系最密切，且与地域特征、流行特点等因素存在联系。因PCV3发现时间相对较晚，故在预防该病毒时应注意强化饲养管理，采用全进全出、加强消毒灭菌等手段；积极构建特异性强且精确性高检测方法，从生物学研究方向出发，结合其病原学特性，为PCV3疫苗的研发创造条件。PCV不具备血凝性，对热具有一定的耐受力，通常温度上升至80℃才会失去感染能力。在日常生活中，可以借助氢氧化钠、四价铵化合物以及苯酚作为消毒剂防止PCV3的入侵。

4 结论

本研究在母猪妊娠流产胎儿的内脏结构中检测到PCV3的存在，且其他病原检测结果均呈阴性，表明PCV3是导致此次母猪流产的关键病原。