信阳毛尖茶残次品中茶多酚提取工艺优化及抗氧化性研究

袁佩颖，杨潇剑,2，吴振威，荣倩倩，张 姝，任移嵘

（1.信阳学院 理工学院,河南 信阳 464000；2.信阳学院 分析测试中心,河南 信阳 464000）

信阳毛尖是河南省信阳市著名特产，属于我国十大名茶，营养丰富，富含茶多酚等多种营养成分。相关研究表明，长期饮用信阳毛尖可以有效起到抗菌消炎、清除体内自由基、降低人体胆固醇、抑制细胞癌变等作用。

据公开数据统计，截至2019年，信阳市茶园面积14.25万hm，茶叶产量达7.2万t，预测到2022年茶叶产量达到8.2万t。根据相关研究及实际走访，笔者发现在制茶过程中大约会产生35%的残次品，一般为大叶、老叶、茶末和梗等。再加上市场对信阳毛尖“一芽一叶”和“嫩芽”2种工艺的追捧，势必会产生更多的残次品，原材料浪费严重。信阳毛尖中的残次品品相较差，茶汤苦涩偏黄，诸多加工作坊便以“口粮茶”的名义对外售卖，价格低廉，甚至是成品茶的百分之一，其经济价值较低。由此可见，信阳毛尖残次品对深加工的需求更为强烈。因此，从信阳毛尖茶残次品中提取天然活性物质便成为回收利用的有效途径之一。

茶多酚是茶叶中重要的生物活性物质和色香味的主要成分，是多酚类物质的总称，其含量占茶叶干质量的10%～36%。茶多酚能够控制自由基的产生、阻断人体内过氧化过程、抑制肿瘤生长，以及降低紫外线对人体皮肤的伤害等。因此，茶多酚被广泛应用于食品、保健、医疗等领域，发展前景广阔。经相关研究，信阳毛尖中茶多酚含量明显高于六安瓜片和碧螺春等其他绿茶，与普洱生茶基本相同。同时，信阳毛尖不同部位的茶多酚含量也不尽相同，茶多酚含量由高到低为第一叶（22.34%～26.39%）＞芽＞第二叶＞梗（15.07%～16.82%）。

当前已有学者关注了茶叶残次品中茶多酚、多糖、总黄酮等活性物质的提取。例如，吴金松研究了信阳毛尖茶末中多糖的分离纯化以及其抗氧化活性；冯欢欢利用响应面优化机械化学法来提取茶末的总黄酮；兰林等重点关注了竹叶青茶茶末中茶氨酸的提取工艺的优化。目前，针对信阳毛尖残次品中茶多酚的相关研究还未见报道。

本研究选用信阳毛尖残次品为原料，利用超声辅助溶剂萃取技术来提取茶多酚，并用响应曲面法进行优化，之后对其清除强氧化性自由基的能力进行了探究。该研究主要聚焦在信阳毛尖残次品中茶多酚的提取上，同时对信阳毛尖中茶多酚的抗氧化性研究进行了补充。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

信阳毛尖茶残次品（信阳市罗山县出产的非市售农家茶）；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、酒石酸钠（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；没食子酸—水合物（分析纯，上海笛柏生物科技有限公司）。

DHG-9240A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ-500DE超声波清洗器（昆山市舒美超声仪器有限公司）；BSA124S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；GWB-1SUPER超纯水机（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 茶叶预处理 信阳市罗山县出产的非市售信阳毛尖残次品，其特点是叶大梗大。将茶叶散置于表面皿中，放入烘箱中80℃烘干12 h，去除多余水分，取出烘干的茶叶均匀放入粉碎机中，粉碎至粉末，并过40目筛，以便与溶剂接触均匀，然后将粉末放入保鲜袋冷藏。

1.2.2 茶多酚的检测及计算 根据邓祥等对酒石酸亚铁比色法和福林酚比色法进行的对比研究，得出酒石酸亚铁标准曲线法相比福林酚比色法，具有更宽的线性范围；同时，酒石酸亚铁比色法测定茶叶提取物中茶多酚含量具有较高的可信度。因此，本试验中将使用酒石酸亚铁比色法进行茶多酚的测定。

离心后立即用移液器取提取后的上清液1 mL并稀释25倍，吸取稀释后的茶多酚提取液2 mL注入50 mL容量瓶中，加去离子水8 mL和酒石酸亚铁溶液10 mL，充分混合均匀，再加pH值为7.5的磷酸缓冲液30 mL至刻度线。用空白溶液作参比，使用10 nm比色皿，在540 nm处测吸光度，根据标准曲线得出茶多酚提取率。

1.2.3 单因素影响试验方法 取粉碎好的茶粉1.0 g于50 mL试管中，加入一定量的乙醇水溶液，然后在试管口盖上保鲜膜，防止乙醇挥发，混匀后投入到超声波清洗器中，接着在不同乙醇浓度、超声时间、料液比的条件下开始进行单因素超声提取试验，分别考察其对茶多酚提取率的影响。

1.2.4 响应曲面设计方法 通过3组单因素试验，以乙醇浓度（A）、超声时间（B）、料液比（C）为响应因子，分别以最高点作为编码水平0，最高点的左边作为编码水平-1，最高点的右边作为编码水平1，并且以提取率为响应值做响应曲面设计，最后采用Design Expert中的Box-Benhnken中心组合设计原理来分析处理。

1.2.5 抗氧化性测试方法 取优化后提取的茶多酚原溶液1 mL稀释100倍，并配制相同质量分数浓度的维生素C溶液，再分别取0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL稀释后的溶液加入到6支比色管中，加水稀释到5 mL，再加入5 mmol·L的水杨酸溶液和5 mmol·L的FeSO溶液各5 mL，混匀后加入5 mL的稀HO，在35℃下水浴反应30 min，于510 nm处测其吸光度值记为，用蒸馏水代替水杨酸的吸光度记为，以蒸馏水代替茶多酚稀释液的吸光度记为。按照下式计算茶多酚对·OH的清除率。

1.3 数据分析

试验均重复3次，采用Origin 8.0软件进行图表绘制，采用Design-Expert 8.0.6统计软件进行响应面优化分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度的影响 准确称取信阳毛尖残次品粉末1.0 g于50 mL试管中，采用料液比为1∶16 g·mL，超声时间为30 min，乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%进行试验。从图1-A可以看出，在乙醇浓度在50%～70%时，提取率逐步上升；当乙醇浓度为70%时，提取率达到最高值；乙醇浓度为70%～90%时，提取率开始下降。这表明提取率不会随乙醇的浓度增加而一直增加。原因可能是乙醇浓度不断增加会使脂溶性杂质和色素等杂质大量溶解出来，进而影响茶多酚的溶出，使茶多酚提取率降低。因此，选择乙醇浓度60%、70%、80%为响应面优化的3个水平。

2.1.2 超声时间的影响 准确称取信阳毛尖粉末1.0 g于50 mL试管中，采用料液比为1∶16 g·mL，乙醇浓度为70%，超声时间分别设定为30、40、50、60、70 min进行试验。从图1-B可以看出，在30～50 min内，随着超声时间的增加，提取率逐步上升；在50 min时，提取率上升到16.22%，达到最高；超过50 min后，提取率又开始下降。这表明提取率不会随超声时间的增加而一直增加。时间较短时，乙醇对信阳毛尖茶粉溶解不够充分，提取率偏低；但时间过长时，可能会引起超声波的空化效应和热效应，致使局部温度过高，使得茶多酚氧化或分解，降低提取率。因此，选择超声时间40、50、60 min为响应面优化的3个水平。

2.1.3 液料比的影响 准确称取信阳毛尖粉末1.0 g于50 mL试管中，采用超声时间为50 min，乙醇浓度配制成70%，分别把料液比设定为1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24 g·mL进行试验。从图1-C可以看出，在料液比为1∶8、1∶12、1∶16 g·mL时，茶多酚的提取率逐步上升，在料液比为1∶16 g·mL时，提取率上升到14.40%，随后提取率开始下降。这表明茶多酚的提取率不会随着乙醇体积的增加相应增加。乙醇体积较小的原因可能是信阳毛尖茶粉与溶剂接触不充分，不利于茶多酚的提取；乙醇体积较大时，信阳毛尖茶粉与溶剂充分接触，但较多的溶剂会吸收一定量的超声波转化为热能，这可能会降低了超声波对细胞壁的破碎能力，导致细胞内的茶多酚溶出减少，提取率下降；也有可能是茶多酚分子上的羟基与乙醇形成氢键作用，乙醇体积越大氢键作用逐渐增强，从而导致茶多酚的提取率降低。因此，选择超声时间1∶12、1∶16、1∶20 g·mL为响应面优化的3个水平。

图1 3种因素对茶多酚提取含量的影响

2.2 响应曲面法的优化

2.2.1 试验结果分析 根据单因素试验的结果，列出响应曲面法设计因素与水平如表1所示。通过Box-Benhnken中心组合设计对单因素结果分析，得到17组试验，按照上述方法分别进行这17组试验，并得出茶多酚提取率，结果见表2。

表1 响应曲面法设计因素与水平

表2 响应面实验设计方案与结果

对表2数据进行多元回归拟合，得到以茶多酚提取率（）为应变量，以乙醇浓度（），超声时间（）和料液比（）这3个单因素为自变量的编码多元二次回归方程如下所示，并对该回归方程进行方差分析。

由表3可知，=31.82，＜0.000 1，表示回归方程极其显著，=0.9761表示模型可信度高，模型拟合较好，=0.945 5表示单个变量占引起茶多酚提取率变化的94.55%。失拟项的=2.33，=0.2162（＞0.05），可见失拟项表现为不显著，这表明未知因素对试验结果的影响比较小，该回归方程模型能够较为客观地反映试验内容，可以用于对试验结果进行替代分析。

同时由表3回归模型系数显著性检验表明，模型一次项极显著，不显著；交互项显著，不显著，因此在本试验中对茶多酚提取率的影响因子的大小顺序为：乙醇浓度因子作用效果显著，料液比因子作用效果次之，超声时间因子作用效果最不显著，即＞＞。同时，利用Design-Expert 8.0.6统计软件做出3D曲面图，结果如图2所示。

表3 回归方程方差分析表

3D响应曲面卷曲程度越明显，则说明2因素间交互作用越明显，对提取率造成的影响越大，反之亦然。由图2可知，乙醇浓度（）和料液比（）、超声时间（）和料液比（）的曲面图卷曲程度相对明显，说明乙醇浓度和料液比、超声时间和料液比两两因素间有比较好的交互作用；而乙醇浓度（）和超声时间（）的响应曲面卷曲程度不是很明显，说明乙醇浓度和超声时间这2个因素的交互作用对茶多酚的提取最不显著，这与表3回归方程方差分析结果一致。

图2 交互作用曲面图

2.2.2 响应曲面分析与优化 根据软件预测得出的最佳条件和提取率即乙醇浓度配制为74.3%、超声时间设定为48.2 min、料液比为1∶18.8 g·mL，此时提取率最高为19.47%。

为了验证这一结论可靠性，在得到的最优条件下重复3次试验，得到平均提取率为19.34%，理论值比较偏差为0.13%，即模型预测的结果与实际实验的情况很符合，说明此模型可行。

2.3 抗氧化性试验结果

·OH是氧化性极强的自由基，可以与细胞中的许多分子发生反应，从而引起各种病变，引发疾病和衰老。由图3可见，在茶多酚溶液0.5～2.5 mL的投加量范围内，即含量在51.45～308.7 μg范围内，随着信阳毛尖残次品中提取的茶多酚溶液投加量的增加，其对·OH清除能力逐渐提升，基本呈线性关系，展示出非常好的量效对应关系；在投加量达到2.5 mL，其对·OH清除率达到97.3%，当投加量超过2.5 mL时，其对·OH清除能力基本不变，投加量在3 mL时，清除率为97.9%。由此可见，稀释过后的茶多酚溶液在投加量为2.5 mL时，其清除·OH的能力已达到最优，此时茶多酚含量为257.25 μg，根据清除率拟合曲线=(33.827+13.05)×100%（表示清除率，表示茶多酚溶液投加量，0.5≤≤2.5），得到信阳毛尖残次品茶多酚对羟基自由基的ID50为1.09 mL，即112.40 μg，维生素C清除羟基自由基的ID50为147.20 μg。由此可见，该型信阳毛尖残次品中茶多酚相对于维生素C而言，其对·OH清除能力更强。

图3 茶多酚溶液投加量对·OH清除的影响

3 结论与讨论

（1）使用响应曲面法对超声辅助下信阳毛尖茶残次品中茶多酚的提取进行优化，其在乙醇浓度为74.3%、超声时间48.2 min、料液比为1∶18.8 g·mL的最佳工艺条件下所提取的茶多酚为19.34%。

（2）该提取率与其他研究得出的信阳毛尖成品茶中茶多酚提取率（36.2%）还有不小的差距。究其原因，本试验采用的茶叶为信阳毛尖中的残次品，大叶、老叶和梗比较多，茶多酚含量相对较低，这一结果也与相关针对茶叶不同部位茶多酚含量的研究结果类似。

（3）抗氧化性试验结果表明，信阳毛尖残次品中的茶多酚具有较强的·OH清除能力，可应用到食品保健等前述领域，发展前景广阔。

（4）当前，对信阳毛尖茶残次品的深入加工研究和应用还是比较少的，使得次等茶叶原材料产生了极大浪费，本试验采用的工艺流程简单，设备易得操作要求较低，为信阳毛尖残次品的回收利用提供解决问题的路径。

（5）同时本研究与其他科研人员所做的工作都是在为信阳当地茶产业的发展找寻其他途径，关注茶叶尤其是品级较低、量大的残次品中各种天然活性营养物质的深度加工利用，这对于发展本地食品、医药、保健等高端产业工业都是有非常大的促进作用。