基于网络药理学和分子对接探讨裘氏二藤汤治疗慢性盆腔炎的机制

王相安 张 匀 王慧铭

慢性盆腔炎为盆腔腹膜、生殖器及周围组织发生的炎症反应，临床上西医治疗多以抗生素为主，由于病灶多位于盆腔组织深部，抗生素难以获得较高血药浓度，且长期使用抗生素易造成耐药性及菌群失衡[1]。该病属中医“妇人腹痛”“癥瘕”“带下病”等范畴，主要是经期产后，不慎房事或感染外邪，湿热之邪浸注下焦，留注冲任、胞宫而至，治疗当以活血化瘀、清热利湿、理气止痛、通经活络为主[2]。裘氏二藤汤出自全国首批名老中医药专家学术经验继承工作指导老师、国家级名老中医裘笑梅教授，由忍冬藤、大血藤、赤芍、川楝子、丹参、延胡索、大黄、大青叶、甘草、牡丹皮、蒲公英这11 味中药材组成，广泛应用于盆腔炎症性疾病，并取得良好的临床疗效[3]。本研究基于网络药理学对二藤汤的主要活性成分、作用靶点、基因通路等方面进行分析，通过分子对接方法验证活性成分与靶点的结合能力。

1 资料与方法

1.1 二藤汤的活性成分及作用靶点的筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）[4]及中医药综合数据库（Traditional Chinese Medicine Integrative Database，TCMID）[5]检索二藤汤中11 味药物的活性成分，设定口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 为筛选条件，进行活性成分的筛选，以获得二藤汤的主要活性成分。将收集的主要活性成分输入TCMSP 数据库中，检索主要活性成分的潜在靶点并去除没有检索到靶点的活性成分。同时，利用UniProt 数据库[6]，限定物种为“homo sapiens”，校准主要活性成分对应靶点的基因信息，得到标准化的靶点名称。

1.2 “中药-活性成分-药物靶点”网络的构建 利用筛选出的活性成分和靶基因在Cytoscape3.7.2 软件上绘制二藤汤-活性成分-靶基因网络，运行Network Analyzer 插件进行拓扑分析，根据degree 值大小筛选出核心成分。

1.3 慢性盆腔炎相关靶点的筛选 利用Genecards数据库（相关性评分即Score 值≥1.0）[7]和OMIM 数据库[8]，以“Chronic Pelvic Inflammatory Disease”作为检索词分别检索慢性盆腔炎潜在靶点，合并去除重复基因后，最终获得与慢性盆腔炎相关的作用靶点。

1.4 药物-疾病共同靶点的筛选 将二藤汤活性成分作用靶点与慢性盆腔炎相关靶点取交集，并利用Venny 2.1.0 在线软件绘制Venn 图，得到药物-疾病共同的靶基因。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建 将“1.4”获得的交集靶点导入STRING 11.5 数据库中[9]，限定物种为“homo sapiens”，并以置信度≥0.4 为条件筛选，获取蛋白相互作用关系，导出TSV 格式文件，并导入Cytosape 3.7.2 软件中，运行CytoNCA 插件进行拓扑分析并根据degree值筛选出核心靶基因。

1.6 通路和功能富集的分析 将“1.4”获得的交集靶点导入Metascape 平台[10]，将生物种类设定为“homo sapiens”，根据P<0.01，进行GO（gene ontology）富集分析与KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析，并利用R 语言对结果进行可视化处理。

1.7 分子对接验证 在PubChem 数据库[11]获得核心活性成分的2D 结构，并导入Chem3D 软件得到优化后的3D 结构。在PDB 数据库寻找靶蛋白的3D 结构，运用PYMOL 2.3.0 对靶蛋白进行去水分子及去配体等操作，同时利用AutoDock 4.2.6 软件对靶蛋白进行加氢，最后，利用AutoDock Vina 1.1.2 软件将受体蛋白与配体小分子进行分子对接并用PYMOL 2.3.0 进行可视化。

2 结果

2.1 二藤汤的活性成分和作用靶点收集 设定OB≥30%且DL≥0.18 及剔除没有相应靶点的活性成分后，从TCMSP、TCMID 共获取231 种活性成分，其中赤芍9 种，川楝子5 种，大黄8 种，大青叶6 种，大血藤1 种，丹参56 种，甘草80 种，牡丹皮1 种，蒲公英2 种，忍冬藤2 种，延胡索46 种，15 种各药物间共同的活性成分，利用UniProt 数据库校准所有靶点名称，去除重复及无效值后共得到308 个靶点。为方便后续研究，按药物的首字母缩写进行编码，其中赤芍活性成分被标记为CS1-CS9，以此类推，川楝子、大黄、大青叶、大血藤、丹参、甘草、牡丹皮、蒲公英、忍冬藤、延胡索各自的活性成分被标记为CLZ1-CLZ5、DH1 -DH8、DQY1 -DQY6、DXT1、DS1 -DS56、GC1-GC80、MDP1、PGY1-PGY2、RDT1-RDT2、YHS1-YHS46。15 种共同的活性成分被标记为A1-O1。

2.2 “中药-活性成分-药物靶点”网络的构建 通过Cytoscape3.7.2 绘制中药-成分-靶点网络，网络总共包括550 个节点（11 个药材节点、231 个活性成分节点、308 个靶点节点）和5373 条边，见图1。通过内置的Network Analyzer 分析该网络拓扑学参数，并根据degree 值大小选取排名前15 的核心成分，见表1。

表1 二藤汤的核心活性成分信息

2.3 慢性盆腔炎靶点的收集与韦恩图的构建 利用GeneCards 数据（Relevance score≥1.0）库和OMIM数据库，以“Chronic Pelvic Inflammatory Disease”为关键词，检索慢性盆腔炎的靶点，并将两个数据库得到的靶点合并删除重复值后,共得到4835 个靶点，与二藤汤相关的308 个靶点同时导入Venny 2.1.0 在线软件进行交集分析并绘制Venn 图，共获得211 个交集靶点，即为二藤汤治疗慢性盆腔炎的潜在作用靶点。见图2。

2.4 PPI 网络的构建 将二藤汤与慢性盆腔炎的211 个共同靶点导入STRING 数据库，限定物种“Homo sapiens”，设置置信度≥0.4，获取蛋白相互作用关系图及TSV 格式文件，见图3。将TSV 格式文件导入Cytoscape3.7.2 软件中，运行CytoNCA 插件对共有靶点进行拓扑分析，并根据degree 值大小筛选前20位关键靶点，进行网络构建得到关键靶点PPI 网络图，见图4。同时根据度值的大小进行排列，得到PPI网络中核心靶点柱状图，见图5。

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 利用Metascape 平台，设置P<0.01 作为筛选条件，将交集靶点进行GO 的生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellular component，CC）分析，总共富集到2538 个条目，其中2174 项BP，233项MF，131 项CC，根据富集显著程度筛选出排名前10 的条目，并利用R 语言绘制柱状图，见图6。其中，BP 主要涉及细胞对脂质及氮化合物的反应，外来刺激的反应等；CC 主要涉及等细胞质膜、激素受体复合物等；MF 主要涉及等DNA 结合转录因子、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子等。

2.5.2 KEGG 通路富集分析 利用Metascape 平台，设置P<0.01 作为筛选条件，将交集靶点进行KEGG分析，共得到209 条信号通路，根据富集显著程度筛选出排名前20 条目，并利用R 语言绘气泡图，见图7。主要涉及糖尿病并发症中AGE-RAGE 信号通路、雌激素信号、MAPK、AMPK 等信号通路,同时，为了进一步探索排名前10 种活性成分及其靶点在疾病通路中发挥的作用，运用Cytoscape 3.7.2 构建“活性成分-靶点-通路”网络，见图8。

2.6 分子对接结果 使用AutoDock Vina 1.1.2 软件对排名前8 位的关键靶点和活性成分进行分子对接（见表2）。结合能值越低，二者的结合效果越好，通常以结合能≤-5.0 kJ/mol 作为标准。结果显示，各靶点和活性成分之间对接的最低结合能结果均小于-5.0 kJ/mol，说明活性成分与受体蛋白具有较好的结合活性，进一步验证了上述网络药理学的结果。其中，活性成分与AKT1 及CASP3 对接后的平均结合能最小，故选取与AKT1 及CASPS 的对接结果并用PYMOL 2.3.0 展示，见图9。

表2 核心活性成分和核心靶蛋白的结合能（kcal/mol）

3 讨论

本研究通过“药物-成分-靶点”网络筛选出核心活性成分主要为槲皮素、木犀草素、山奈酚等。槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物，具有减少炎症细胞因子分泌、抗氧化、清除自由基等药理作用[12]，槲皮素通过调节分子伴侣HSC70 负向控制MNSFβ 从而抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子[13]。木犀草素通常以糖基化形式存在于各种药材及食物中,动物实验表明，木犀草素通过调控小鼠骨髓来源的巨噬细胞的极性而抑制炎症反应[14]。山奈酚可以通过对Dectin-1 和p38 MAPK 通路的抑制，下调白介素-1β（IL-1β）、TNF-α等炎症因子的表达[15]。因此，笔者推测二藤汤的关键活性成分主要通过抗炎机制作用于慢性盆腔炎。

PPI网络分析表明，AKT1、TNF、IL6、ESR1 及PTGS2 等均具有较高的度值，可能是二藤汤发挥抗慢性盆腔炎作用的关键靶点。AKT1、TNF、IL6 均参与免疫及炎症反应。细菌感染后炎症因子迅速升高，促进炎症细胞激活，引起盆腔周围结缔组织发生充血、水肿，逐渐演变成慢性盆腔炎[16]。PTGS2 又称环氧化酶-2（COX-2），是一种前列腺素生成的合成酶，在促炎细胞因子、生长因子等诱导下，参与炎症反应、细胞增殖及凋亡等多种病理过程，ESR1 编码雌激素受体，当与雌激素结合，释放致痛物质，导致慢性盆腔痛的发生[17]。

KEGG 通路分析显示药物作用靶点主要富集于MAPK、AMPK 及GE-RAGE 信号等于炎症及疼痛相关的通路。其中，AMPK 信号通路激活可以抑制LPS诱导的巨噬细胞M1 型极化，减少TNF-α、IL-6 等炎症因子的释放，从而抑制炎症反应[18]。MAPK 信号通路与细胞增殖、凋亡及炎症反应密切相关，研究表明，通过抑制miR-21 的表达进而抑制MAPK 信号通路的活化，可以起到抗炎及止痛作用[19]。AGERAGE 信号通路在糖尿病及其并发症的形成与发展中发挥重要作用，AGEs 可以激活RAGE，会引起全身性炎症反应和氧化损伤[20]。

综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接初步预测裘氏二藤汤多成分、多靶点、多信号通路治疗慢性盆腔炎的分子机制，符合中医“整体观”理论。本研究存在一定局限性，由于公共数据库是实时更新的，所以本研究结果只在一定程度上揭示二藤汤抗慢性盆腔炎的作用机制，后续有必要进行细胞或动物实验加以验证。