基于倾向性评分匹配探讨载脂蛋白E水平及其基因多态性与脑血栓形成的相关性分析*

黄 杰，黄华玲，王 鹏，谢东德， 李海燕 ， 董少文

1.南方医科大学附属佛山医院检验科，广东佛山 528000；2.海南医学院热带医学与检验医学院，海南海口 571199；3.南方医科大学附属佛山医院神经内科，广东佛山 528000

在我国住院的急性脑卒中患者中，3个月内病死率为9.0%～9.4%，致残率为34.5%～37.1%[1]。在脑卒中的发病常见因素中，约60%是因脑血栓形成导致。脑血栓是一种在脑血管内淤血、凝血倾向增加、脑血管管壁自身病变及脑血管血流减慢情况下，血液中的红细胞、纤维蛋白和血小板附着在血管壁上而形成的血栓，是由多种因素影响造成的疾病。有研究表明，脑血栓形成的危险因素包括高血压、高脂血症、高胆固醇、高血糖及部分血清载脂蛋白(Apo)标志物等[2]。ApoE是一种参与调节脂质代谢的多态性脂蛋白，ApoE基因可通过产生多态性蛋白，参与脂蛋白的转化和代谢过程，其基因多态性决定血脂水平，与许多脑血管病的发生和发展相关[3]。目前，虽已有部分关于ApoE基因多态性或ApoE水平与脑血栓形成的相关性研究，但很少有文献同时分析ApoE水平及其基因多态性与脑血栓形成的相关性。而且由于脑血栓形成的危险因素较多，容易造成混杂变量偏倚及数据偏差，导致部分专家与学者的研究结果不尽相同。倾向性评分匹配(PSM)已广泛应用于观察及临床非随机化数据的研究，根据PSM得出与实验组混杂影响因素分布均匀的对照组，从而减少偏倚[4]。本研究旨在探讨ApoE水平及其基因多态性与脑血栓形成的相关性，为保证研究结果更具科学性及客观性，采用PSM方法，能够在设计和分析阶段有效平衡对照研究中与脑血栓形成相关危险变量的偏倚，从而获得ApoE各基因型与脑血栓形成的客观相关性数据，以及各基因型对应的血清ApoE水平，探讨ApoE水平及其基因型是否可作为用于监测及早期评估脑血栓形成的新标志物。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年12月至2021年1月在南方医科大学附属佛山医院神经内科门诊拟诊为早期脑血栓形成的312例患者作为研究对象，对其进行评估并随访6个月，根据随访期间再次就诊情况，结合临床症状及影像学诊断结果，将疑似患者分为脑血栓组(144例)和对照组(168例)。其中男148例，女164例。纳入标准：符合文献[5]的相关诊断标准，包括：(1)临床症状，表现为头晕、乏力、肢体麻木、感觉障碍、构音障碍、意识障碍等；(2)神经专科检查，包括病理反射阳性，腹壁及提睾反射减弱或消失；(3)采用美国国立卫生研究院卒中量表对脑梗死进行评分，分数越高表示脑梗死对神经系统的影响程度越大；(4)颅脑CT血管造影(CTA)、磁共振成像(MRI)结果提示相关脑梗死责任病灶信息，CTA明确有关血管闭塞或狭窄信息，多模式MRI[包括弥散加权成像(DWI)、灌注加权成像(PWI)]：DWI发现缺血灶，确定病灶大小、部位，PWI显示脑血流动力学改变。排除标准：(1)不愿意配合医学观察研究的患者；(2)有心、肝、肾功能异常的患者；(3)有血液感染、中枢神经系统感染、脑出血、脑肿瘤的患者。高血压判断标准则参照《中国急诊高血压诊疗专家共识(2017修订版)》[6]进行诊断及高血压级别分型。糖耐量异常的诊断标准参照文献[7]执行。收集记录患者首次就诊时的实验室检查项目数据：甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、ApoA、ApoB、D-二聚体(D-D)、纤维蛋白原(FIB)、空腹葡萄糖(Glu)、ApoE及ApoE基因型等。

1.2方法 血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、Glu、ApoA、ApoB、ApoE等项目采用全自动生化分析仪(迈瑞6000i)检测，前5项检测方法分别为胆固醇氧化酶法、选择性清除法、过氧化物酶清除法、免疫化学沉淀法、葡萄糖氧化酶法，后3项检测方法均为免疫透射比浊法。检测标本均为患者首次就诊时抽取的血液标本。标本前处理先使用含有促凝剂和惰性分离胶的真空采血管，将抽取的血液标本置于低速离心机以5 000 r/min离心5 min，并在2 h内完成检测。D-D与FIB则采用日本Sysmex CS 5100全自动凝血仪进行检测，检测方法分别为免疫比浊法和凝固法。D-D与FIB的血液标本为使用枸橼酸钠抗凝后的静脉外周血血浆，血液标本抽取时间与处理原则与生化标本相同。ApoE基因检测通过留取以乙二胺四乙酸二钾抗凝的静脉血，在破碎细胞后，先以柱提法洗脱提纯目的基因，然后采用荧光定量PCR检测得到目的基因型别。以上所有检测项目及检测过程均严格按照各仪器标准操作规程进行操作，以保证结果的准确性。

2 结 果

2.1脑血栓组和对照组PSM前、后基线资料比较 研究对象共312例，其中脑血栓组144例，对照组168例。脑血栓组和对照组PSM前基础资料，如性别、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、HDL-C、ApoB、Glu等比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。采用PSM对两组基础资料进行1∶1近似PSM后成功匹配87对，各协变量均衡性得到提高，两组基础资料差异减小，均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表2。

表1 脑血栓组和对照组PSM前一般资料比较[n(%)或或P25/P50/P75]

表2 脑血栓组和对照组PSM后一般资料比较[n(%)或或P25/P50/P75]

组别nHDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)ApoA(g/L)ApoB(g/L)Glu(mmol/L)FIB(g/L)D-D(g/L)脑血栓组1441.04±0.253.26±1.131.18±0.201.02±0.277.35±2.853.54±1.390.40/0.69/0.99对照组1681.15±0.273.04±1.051.17±0.160.94±0.266.29±1.863.31±0.980.27/0.76/0.94χ2/t/Z3.6131.7570.4622.0503.7811.600-1.535P0.0430.0800.6380.0150.0180.1110.125

续表2 脑血栓组和对照组PSM后一般资料比较[n(%)或或P25/P50/P75]

2.2脑血栓组和对照组ApoE基因型和基因携带分布情况比较 经PSM成功后的87对数据中，脑血栓组主要以ε3ε3、ε3ε4及ε4ε4 3种ApoE基因型组成，而对照组主要由ε2ε3、ε3ε3和ε3ε4 3种ApoE基因型组成。脑血栓组ε3ε4及ε4ε4基因型频率明显高于对照组，ε2ε3基因型频率明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；脑血栓组和对照组ε2ε2、ε2ε4和ε3ε3基因型频率差异均无统计学意义(P>0.05)。脑血栓组携带ε4基因频率明显高于对照组；携带ε2基因频率明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 脑血栓组和对照组ApoE基因型和基因携带率分布情况比较[n(%)]

2.3不同ApoE基因型在脑血栓组和对照组中ApoE水平比较 经过PSM成功后的87对数据中，不同ApoE基因型脑血栓组对应的ApoE水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，高水平ApoE可能是脑血栓形成的独立危险因素；无论是脑血栓组还是对照组，携带一个或超过一个ε4基因(≥1个ε4)时，其对应的ApoE水平均明显高于其他基因型，差异均有统计学意义(P<0.05)，ε4基因型是ApoE的高危基因型。见表4。

表4 不同ApoE基因型在脑血栓组和对照组中ApoE水平比较

3 讨 论

脑卒中是全球第二大死亡原因，也是致残的主要原因，而脑血栓形成是脑卒中最常见的发病原因，占全部脑卒中的60%左右[8]。急需通过早期、快速、全面检查和评估来预测脑血栓形成的风险，并尽早进行临床干预及治疗，有助于做好疾病的一级预防。然而，临床上常规颅脑MRI检查评估并无法明显提高早期脑血栓形成的诊治效率，因为严格的急性脑梗死诊治定义与影像学检查结果本身就密不可分[9]。所以，想要在早期对急性脑梗死进行病情恶化的可能性预测，需要更多的实验室诊断技术加以实现。目前，在与脑血栓形成相关的研究领域，有关ApoE的研究正逐步成为新的热点。有研究表明，血清ApoE是脑血栓形成的危险因子， ApoE基因多态性与脑血栓的形成存在相关性，但是与脑血栓形成相关的危险因素较多，包括血压、血脂、血糖及机体血液的高凝状态，以及血管本身的病变等[10]，并且各因素之间也存在相互影响。有研究表明，携带ApoE-ε4基因型的脑卒中患者TC和LDL-C水平均明显高于携带ε2和ε3基因型的患者，得出ApoE基因多态性与缺血性脑卒中发病存在关联[11]。 但是，血脂水平早已被证实是脑血栓形成的危险因素之一[12]。究竟是血脂的总体水平导致了脑血栓形成的风险，还是其中的ApoE基因型起到决定性作用?为解决这个变量间偏倚的问题，本研究采用PSM方法，在实验设计和分析阶段有效平衡对照研究中与脑血栓形成相关危险变量的偏倚，以便提高ApoE基因与脑血栓形成相关性研究结果的准确性及可信度。

ApoE基因主要通过影响脂蛋白对脂类的转运而影响血脂水平。ApoE基因包括3种基因亚型(ε2、ε3、ε4)和6种表型(ε2 ε2、ε2 ε3、ε2 ε4、ε3 ε3、ε3 ε4、ε4 ε4)[13]。本研究结果显示，脑血栓组ε3ε4及ε4ε4基因型频率明显高于对照组，也就是说脑血栓组携带ε4基因的频率明显高于对照组，这与SMITH[14]的研究结果一致。脂质代谢基因影响动脉粥样硬化形成的病理过程[15]，ε4基因是导致动脉粥样硬化的独立危险因素，与个体血浆TC水平升高及心脑血管病的发生具有相关性[16]；相反，ε2基因能够降低血浆TC水平[17]，从而降低脑血栓形成的风险。CHOWDHURY等[18]的研究证实，ε2和ε4基因所产生的蛋白质产物具有对脂蛋白的分离和反向影响。所以，本研究对照组携带ε2基因频率更高，具有准确性及科学性。而携带ε3基因频率在两组间的差异无统计学意义(P>0.05)，主要是因为ε3基因最为常见，并且其产生的ApoE多态性脂蛋白被认为并不是高风险的脂蛋白[19]。

李秀锋等[20]研究发现，ε4基因的存在会影响血清中脂蛋白水平。本研究通过分析脑血栓组和对照组不同基因型所对应的ApoE水平发现，无论是脑血栓组还是对照组，携带ε4基因型时，其对应的ApoE水平均高于其他基因型，同样证实了ε4基因影响血清ApoE水平。此外，脑血栓组不同ApoE基因型对应的ApoE水平均明显高于对照组同种基因型，也就是说脑血栓患者血清中ApoE水平更高，这与黄柳等[21]的研究结果一致。有研究结果提示，动脉粥样硬化严重程度与ApoE启动子多态性可能存在联系，参与调控ApoE转录的过程。此外，脑梗死患者血清ApoE水平明显增高，除含有高危基因(ε4基因)外，还可能与神经源性ApoE增加有关[22]，具体机制可能与MTHFRC677T基因多态性有关。

综上所述，本研究采用PSM对研究过程中的混杂因素与数据偏倚进行有效平衡后，得出ApoE水平及其基因多态性与脑血栓的形成有关。脑血栓形成患者血清ApoE水平明显升高，通过监测血清ApoE水平变化可用于早期评估脑血栓形成的风险；而ε4是ApoE的高危基因型，其对应的血清ApoE水平增加幅度明显高于ε2和ε3基因型。所以，同时监测ApoE水平及其基因多态性，对辅助脑血栓形成的早期诊治及预防具有较大的临床应用价值。