68Ga标记成纤维细胞活化蛋白抑制剂的生物分布和胶质瘤模型micro-PET显像

向一立，钟 璇，付晶晶，吴文雨，邵国强，王 峰，张 俊

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.泰州市人民医院 核医学科，江苏 泰州 225300；3.南京医科大学附属南京医院、南京市第一医院 核医学科，江苏 南京 210006)

成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)在多种肿瘤的相关成纤维细胞中高度表达，但在正常组织表达有限，FAP同时还具有二肽基肽酶(the dipeptidyl peptidase, DPP)和肽链内切酶活性，成为一种独特的诊疗靶点[1-2]。目前，已有靶向FAP的多肽、抗体、纳米颗粒和小分子抑制剂[3]等相关研究报道，其中FAP小分子抑制剂(FAP inhibitor, FAPI)备受关注。基于Jansen等[4-5]研究，Lindner和Loktev等[6-8]研发了一系列FAPI衍生物，其中FAPI-04展现了较好的应用潜力。Kratochwil等[9]将68Ga-FAPI-04应用于28种不同肿瘤显像，分析得出一系列潜在适应症，如肉瘤、食管癌、肺癌、乳腺癌、胆管癌等，表明68Ga-FAPI-04可能在肿瘤诊断、分期、疗效评估等方面具有良好前景。68Ga-FAPI-04是广谱亲肿瘤显像剂，目前已开始用于临床研究，但临床对其最佳显像适应证仍处于探索阶段。国内已有研究显示，肝癌HepG2荷瘤裸鼠的68Ga-FAPI-04 micro-PET肿瘤显像清晰[10]。由于临床常用的PET显像剂18F-FDG在正常脑组织高度摄取，其在脑肿瘤中的诊断价值有限。研究发现，胶质母细胞瘤中内皮细胞和周细胞等多种细胞均表达FAP，因此可利用此靶点对胶质母细胞瘤进行诊断和治疗[11-15]。已有多项临床前研究通过FAP酶活性抑制剂、FAP疫苗[16]、FAP特异性嵌合体抗原受体T细胞[17]、放射性标记抗FAP单克隆抗体等方法对肿瘤进行靶向诊疗。Pandya等[3]用放射性标记抗FAP单克隆抗体F19，对FAP阳性的U87MG荷瘤鼠进行了一系列研究，89Zr-Df-Bz-F19的切伦科夫发光成像(cerenkov luminescence imaging, CLI)和micro-PET均显示了良好的肿瘤摄取与较高的TBR。在核医学和放射性药物研究领域，通过靶向FAP对肿瘤进行PET显像是目前的研究热点之一。本研究利用68Ga标记FAPI-04，对神经胶质母细胞瘤进行体内外研究，评估其在胶质母细胞瘤PET显像中的价值，通过生物分布、显像分析68Ga-FAPI-04更佳适应证。

1 实验材料与仪器

1.1 细胞株和实验动物

人脑胶质母细胞瘤细胞株U87MG：美国ATCC公司；8只4～6周BALB/c雌性裸鼠，20只4～6周龄雌性ICR小鼠：许可证号为SCXK(苏)2016-0010，均于无特殊病原体(specific-pathogen free, SPF)环境中饲养，常州卡文斯实验动物有限公司。

1.2 主要试剂

FAPI-04前体：江苏华益公司；DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)：Gibco公司；Ultrapure纯水、30%Ultrapure盐酸：MerckGmbh公司；99.999%醋酸钠：Sigma公司；无水柠檬酸：福州MXB 生物技术；FAP多克隆抗体：湖南艾方公司；生物素II抗、DAB显色系统：上海Dako公司。

1.3 主要仪器

68Ge-68Ga发生器：德国ITG公司；高效液相色谱仪(high performance liquid chromatog-raphy, HPLC)：LC-20AT，日本岛津公司；放射活度计：CRC-25PET，美国Capintec公司；Zorbax Rax-C18柱：江苏汉邦科技有限公司；Sep-Pak C18 Plus Light固相萃取柱：美国Waters公司；γ计数器：美国WIZARD，PerkinElmer公司；micro-PET/CT：Inveon，西门子公司。

2 实验方法

2.1 68Ga-FAPI-04的制备

将FAPI-04前体溶于0.25 mol/L乙酸钠溶液中备用。以5 mL 0.05 mol/L HCl淋洗68Ge-68Ga发生器，以1 mL/管分别收集淋洗液，取其中活度最高管用于后续标记。在68Ga淋洗液中加入20 μg前体，并以乙酸钠溶液调节淋洗液pH至4.0，置于100 ℃金属浴反应10 min。冷却后通过C18柱，以5 mL生理盐水冲洗除去杂质，加入1 mL 体积分数60%乙醇淋洗并收集产品，用生理盐水稀释后备用。68Ga-FAPI-04的合成路线示于图1。

图1 68Ga-FAPI-04的合成路线

2.2 68Ga-FAPI-04的质量控制及体外稳定性

2.2.1质量控制 采用放射性HPLC检测标记率，计算放化纯度。分析条件如下：流动相A为含体积分数0.1%三氟乙酸的水，流动相B为含体积分数0.1%三氟乙酸的乙腈。流速为1 mL/min。洗脱梯度为：0～5 min：流动相B为0～10%，流动相A为100%～90%；5～10 min：流动相B为10%～50%，流动相A为90%～50%；10～15 min：流动相B为50%～100%，流动相A为50%～0%。分析柱为Zorbax Rax-C18柱。紫外检测器波长为220 nm。

2.2.2体外稳定性 将标记物分别置于胎牛血清(FBS)与磷酸盐缓冲液(PBS)中37 ℃孵育2 h，于0、1、2 h取样用放射性HPLC测定，方法如2.2.1小节。

2.3 脂水分配系数

取3 μL纯化后的68Ga-FAPI-04，加入含有 500 μL正辛醇及500 μL PBS 缓冲液的EP管中，室温震荡1 min，1.2×104r/min离心5 min，设3个复管。依次从 3 个EP 管中取有机相及水相各 200 μL，用γ计数器测量放射性计数。计算LogP值，LogP=Log(正辛醇γ计数/PBSγ计数)。

2.4 小鼠体内生物分布

2.4.1正常小鼠生物分布 取健康ICR小鼠20只，随机分为5组，每组4只。每只小鼠均尾静脉注射3.7 MBq68Ga-FAPI-04(0.1 mL)。分别于注射后5、15、30、60、120 min进行眼球取血，并解剖分离出心、肝、胆囊、脾、肺、肾、胃、肠、胰、脑、肌肉、骨骼等器官和组织，生理盐水清洗并吸去多余水分后置于相应编号的空计数管内。分别称量各器官质量后用γ计数仪测量放射性计数，并计算放射性摄取率(%ID/g)。

2.4.2荷瘤鼠生物分布 4只U87MG荷瘤裸鼠经尾静脉注射0.1 mL 3.7 MBq示踪剂，90 min眼眶取血后用颈椎脱臼法处死，取肿瘤、心、肝、胆囊、脾、肺、肾、胃、肠、胰、脑、肌肉、骨骼等组织样本，称重后用γ计数仪测量各组织的放射性计数，并计算放射性摄取率(%ID/g)以及肿瘤/脑的放射性摄取比。

2.5 U87MG荷瘤鼠micro-PET显像

选取4只BALB/c裸鼠，分别于双上肢肩背部注射0.1 mL 5×106个U87MG细胞，待肿瘤直径约1 cm时用于实验。每只U87MG荷瘤鼠经异氟烷气体麻醉，尾静脉注射68Ga-FAPI-04(0.1 mL 3.7 MBq)后30、60、90、120 min进行micro-PET 静态扫描，采集时间为10 min，能峰350～650 keV，衰减校正后经计算机重建得到U87MG荷瘤鼠静态显像图像。勾画荷瘤鼠主要脏器及肿瘤的感兴趣区域(region of interest, ROI)，绘出时间放射性曲线(time to activity curve, TAC)。

2.6 HE染色及免疫组化

U87MG荷瘤鼠显像完成后，分离出肿瘤组织，福尔马林固定、石蜡包埋后进行HE染色。将FAP抗体稀释后行EnVision二步法染色。石蜡切片脱蜡至水后置入柠檬酸微波抗原修复，3% H2O2室温孵育，滴加FAP 抗体、Ⅱ抗，二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色、脱水、透明、封片。

2.7 统计学分析

3 结果与讨论

3.1 68Ga-FAPI-04的标记合成与质量控制

68Ga-FAPI-04合成时间约20 min，放化产率为68.21%±2.67%(n=3)，纯化后放射性浓度为65.86～90.65 MBq/mL，标记率为97.38%±1.32%(图2)，尾静脉注射前用生理盐水稀释使残留乙醇浓度<10%，68GaCl3的保留时间为(2.8±0.1)min，68Ga-FAPI-04示踪剂保留时间为(5.4±0.1)min。纯化后68Ga-FAPI-04的放化纯度为100.00%±0.00%(n=3)(图2c)。产物为无色透明溶液，pH在6.0～7.0之间。

图2 68Ga-FAPI-04的放射性HPLC分析图

3.2 68Ga-FAPI-04的体外稳定性

标记物置于PBS及FBS中37℃孵育2 h后放化纯度均为100%(图3)，68Ga-FAPI-04体外稳定性好。68Ga-FAPI-04置于PBS中37 ℃孵育0、1、2 h的保留时间分别为5.0、4.8、5.0 min，置于FBS中37 ℃孵育0、1、2 h的保留时间分别为5.3、5.2、5.2 min。

图3 68Ga-FAPI-04体外稳定性实验放射性HPLC分析图

与单克隆抗体F19相比，FAPI-04为小分子，耐高温并且具有对FAP的亲和力高、可标记多种核素等优势。89Zr-Df-Bz-F19制备复杂、89Zr4+与螯合剂结合不稳，而68Ga-FAPI-04标记简易、标记率高、68Ga与DOTA螯合紧密、耐高温。本实验成功制备了68Ga-FAPI-04，并进行了生物分布和脑胶质瘤模型的micro-PET显像研究。

实验结果表明，68Ga-FAPI-04标记方便，标记率大于95%，在生理条件下孵育2 h仍可维持自身基本性状，证实68Ga-FAPI-04体外稳定性好，为后续的体内实验提供了保证。

3.3 68Ga-FAPI-04的脂水分配系数

68Ga-FAPI-04的脂水分配系数LogP为-3.376±0.083(n=3)(表1)，说明示踪剂亲水性较强。

表1 68Ga-FAPI-04在PBS及正辛醇中的放射性计数

3.4 小鼠体内生物分布

尾静脉注射68Ga-FAPI-04后正常小鼠的生物分布结果示于图4，U87MG荷瘤鼠生物分布示于图5。标记物在正常小鼠中主要通过肾脏排泄，5 min时的放射性摄取率为(40.43±12.71)%ID/g，120 min时仅为(1.38±0.07)%ID/g。68Ga-FAPI-04在血液中清除快，5 min时的放射性摄取率为(12.84±0.57)%ID/g，15 min时已降至(4.94±2.73)%ID/g。肝、胆囊、脾、胃、肠、脑中的摄取较低，尤其脑中5 min的摄取值为(0.51±0.11)%ID/g，120 min时仅为(0.03±0.00)%ID/g。U87MG荷瘤裸鼠给药后90 min可见肿瘤组织放射性浓聚，放射性摄取率为(1.68±0.28)%ID/g，肾脏为(14.36±5.40)%ID/g，脑部放射性摄取率低，为(0.09±0.01)%ID/g。

图4 68Ga-FAPI-04在正常小鼠的体内生物学分布

图5 68Ga-FAPI-04在U87MG荷瘤鼠的体内生物学分布(n=4)

68Ga-FAPI-04脂水分配系数测定实验显示，68Ga-FAPI-04亲水性强，提示肾脏为主要排泄器官，与健康ICR小鼠生物分布及U87MG荷瘤鼠micro-PET图像结果一致。生物分布结果显示，68Ga-FAPI-04在血液中清除快，肺、肝、脾和脑中的摄取较低，在脑中摄取最低。U87MG荷瘤鼠micro-PET显像结果显示，脑部放射性摄取较少，与生物分布结果一致，肿瘤摄取明显，肿瘤与脑的TBR高。国内已有学者将68Ga-FAPI-04用于肝癌模型显像，肿瘤部位可见示踪剂的特异性摄取，肿瘤与肝的TBR较高[10]。与此肝癌模型相比，U87MG皮下移植瘤与脑的TBR更高，这可能与FAP在U87MG胶质瘤中高表达而在正常脑组织中低表达有关。由生物分布结果可知，68Ga-FAPI-04在肝脏中的摄取较低，但仍高于其在脑中的摄取，68Ga-FAPI-04在脑中本底更低。另一方面，有文献指出[11]，FAP在脑胶质瘤中的表达引人注目，且普遍表达于脑胶质瘤血管及血管周围，这可能是脑胶质瘤摄取68Ga-FAPI-04高于其他类型肿瘤的原因。因此，68Ga-FAPI-04可能更适用于新生血管丰富肿瘤的临床显像应用。

3.5 荷瘤鼠micro-PET显像

U87MG荷瘤鼠注射68Ga-FAPI-04 后30、60、90、120 min的静态扫描图像(图6)显示，肾脏与膀胱均高放射性摄取，表明68Ga-FAPI-04亲水性好，主要通过肾脏排泄，此结果与脂水分配系数和生物分布结果一致。肿瘤部位快速显影，30 min已见肿瘤明显摄取，但此时本底稍高。随时间推移，本底逐渐降低，肿瘤部位放射性仍较浓聚，肿瘤在注射后30、60、90、120 min时的放射性摄取率分别为(2.10±0.14)%ID/g、(2.30±0.14)%ID/g、(2.50±0.00)%ID/g、(2.45±0.07)%ID/g，肿瘤轮廓清晰。脑部放射性摄取较少，68Ga-FAPI-04注射后30、60、90、120 min的TBR分别为(6.26±0.09)、(5.06±0.02)、(5.54±1.47)、(5.51±0.03)。

图6 荷U87MG裸鼠注射68Ga-FAPI-04后不同时间micro-PET显像图(箭头示肿瘤)

68Ga-FAPI-04 在U87MG荷瘤鼠肿瘤、脑、肌肉中的TAC示于图7。由图7结果可见，30～120 min肿瘤内的放射性摄取较高且基本稳定。脑、肌肉内放射性摄取较低，随时间延长始终未见明显摄取，120 min时脑、肌肉内放射性摄取率分别为(0.44±0.01)%ID/g、(0.44±0.03)%ID/g。

图7 68Ga-FAPI-04在U87MG荷瘤鼠肿瘤、脑、肌肉中的时间放射性曲线

18F-FDG可用于脑胶质瘤的诊断、分期，但正常脑组织高葡萄糖代谢可导致18F-FDG浓聚，降低了脑部病灶检出敏感性。本实验显示，68Ga-FAPI-04在正常脑组织中极少摄取，远低于在肝脏中的摄取，这使得脑的本底更低，更利于发现脑部病变。既往研究显示，FAP在多种肿瘤间质高表达[18]。在脑胶质瘤研究中，U87MG异种移植瘤组织可检测到FAP蛋白[15]，进一步研究显示，FAP可由微环境中多种类型细胞表达，包括胶质母细胞瘤中内皮细胞、周细胞等，肿瘤细胞也有部分表达[11]，这使得FAP成为胶质瘤较好的诊疗靶点。micro-PET实验显示，胶质瘤裸鼠模型肿瘤显影清晰，68Ga-FAPI-04注射120 min后TBR仍高达5.51±0.03，证实68Ga-FAPI-04对胶质瘤具有较好的靶向性。但需注意的是，FAP除在肿瘤间质表达外，也可在创伤愈合和瘢痕组织中表达[19]，因此胶质瘤放疗、化疗或手术引起的修复过程可能导致FAP表达的改变，导致假阳性显像，实际临床应用时需要进行鉴别。

3.6 组织病理

U87MG荷瘤鼠显像完成后处死，取出肿瘤组织，进行HE染色及免疫组化检查，结果示于图8。由图8可知，U87MG胶质瘤组织内可见成纤维细胞胞膜及胞质呈淡黄色或棕黄色，证明其中FAP呈阳性表达。

a——镜下100倍肿瘤组织HE染色；b——镜下400倍肿瘤组织HE染色；c——镜下100倍肿瘤组织免疫组化染色；d——镜下400倍肿瘤组织免疫组化染色

4 结论

68Ga-FAPI-04标记简易、标记率高、体外稳定性好、U87MG荷瘤鼠显像效果佳，这为FAP表达丰富的神经胶质母细胞瘤提供了潜在的新型PET显像剂，为胶质瘤诊疗提供了新的思路。