响应面法优化超声提取芸豆卵磷脂工艺

石瑞，李雪琴，王明华，史晓晶

忻州师范学院生物系（忻州 034000）

芸豆（Phaseolus vulgarisL.），学名菜豆，俗称二季豆、四季豆或者刀豆等，原产于中南美洲，是一种可以使用的豆科植物，其重要性仅次于大豆。芸豆营养丰富，含丰富蛋白质、脂肪、维生素及氨基酸，其成分高钾、高镁、低钠，适合心脏病、高血脂及低血钾症患者食用[2]。

卵磷脂（lecithin），又称为蛋黄素，普遍存在于蛋黄、豆科植物和动物脑等资源中，与蛋白质、维生素并称“第三营养素”。卵磷脂的主要营养成分包括磷脂酰胆碱及不饱和脂肪酸等物质，对人体的细胞活化、生存及脏器功能的维持等有重要作用[3]，适宜人群广泛，在保健方面有相当重要的价值。除此之外，进入老年时期后补充适量的磷脂对老年性痴呆等症状有很好的预防作用。

卵磷脂的提取生产工艺主要有乙醇萃取法、层柱析法、CO2超临界萃取法及膜分离法，对超声辅助提取的研究比较少[4-8]。试验采用超声波辅助乙醇提取芸豆中卵磷脂，并使用响应面优化分析最佳提取工艺，以期为卵磷脂的开发提供更为广阔的市场，为研究芸豆卵磷脂提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

白芸豆（山西市忻州市，试验前带皮粉碎）；磷酸二氢钾、无水乙醇、丙酮、钼酸铵、亚硫酸钠、对二苯酚（均为国产分析纯）。

数控超声波清洗器（KQ3200DV）；可见分光光度计（UV-1800，浙江塞德仪器设备有限公司）；二列八孔智能水浴锅（HK-27，常州金坛良友仪器有限公司）；密封型手提式粉碎机（DXF-04C200g，广州市大祥电子机械设备有限公司）；电子天平（JA203，深圳市科衡仪器电子有限公司）；低速离心机（LC-4016，北京卓山电子科技有限公司）。

1.2 磷标准曲线及回归方程的测定

准确称取0.439 3 g在100～105 ℃烘至恒重的磷酸二氢钾，溶于水中后移入1 000 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，此时1 mL溶液含100 μg磷；移取10 mL此溶液于100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度混匀，此时的溶液中1 mL含10 μg磷，为磷标准溶液。按顺序分别吸取0，0.5，1，2，3，4和5 mL磷标准溶液于7支10 mL具塞试管中，依次加入2 mL 50 g/L钼酸铵溶液、1 mL 200 g/L亚硫酸钠溶液和1 mL对二苯酚溶液，加蒸馏水至刻度线10 mL，静置30 min后，用0号管在波长660 nm处调零后测定吸光度，以质量浓度（c，μg/mL）为横坐标X，以吸光度A为纵坐标Y，绘制得磷标准曲线方程Y=0.010 3X+0.000 8，R2=0.999 7，线性关系良好。

1.3 卵磷脂含量的测定

称取1 g芸豆粉末，加入3 mL丙酮除杂后，加入体积分数80%的无水乙醇溶液，料液比1∶3（g/mL），超声波功率120 W，在40 ℃条件下提取50 min后，冷却离心5 min（4 000 r/min）后，按1.2小节的方法进行试验，根据660 nm处吸光度测定卵磷脂相对含量。测定方法采用的是改进亚硫酸钠钼蓝比色法，根据式（1）计算卵磷脂含量[13]。

式中：X为样品中卵磷脂的含量，mg/100 g；c为由标准曲线算得测定液中磷含量，mg；V1为消化液定容总体积，mL；V2为消化液稀释体积，mL；m为样品质量，g。

1.4 单因素试验

1.4.1 乙醇体积分数对芸豆卵磷脂得率的影响

精准称取5份芸豆粉末，每份1 g，加入3 mL丙酮除杂后，考察无水乙醇体积分数75%，80%，85%，90%和95%对卵磷脂得率的影响。

1.4.2 料液比对卵磷脂得率的影响

精确称5份芸豆粉末，每份1 g，加入3 mL丙酮除杂后，考察料液比1∶2.0，1∶2.5，1∶3.0，1∶3.5和1∶4.0 g/mL对卵磷脂得率的影响。

1.4.3 超声时间对卵磷脂得率的影响

精准称取5份芸豆粉末，每份1 g，加入3 mL丙酮除杂后，考察超声时间30，40，50，60和70 min[15]对卵磷脂得率的影响。

1.5 响应面试验设计

单因素试验基础上，选取乙醇体积分数（A）、料液比（B）、超声时间（C）3个对芸豆卵磷脂提取影响显著的因素，利用Design-Expert 7.1.6软件Box-Behnken中心组合试验和响应面分析法，以卵磷脂得率为响应值，设计三因素三水平响应面分析试验（表1）。

表1 因素水平表

2 结果与分析

2.1 超声波辅助提取的单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数

由图1可知，随着乙醇体积分数加大，芸豆卵磷脂得率与乙醇体积分数变化量呈正相关。体积分数大于95%时达到最高。因此，选择芸豆卵磷脂提取的乙醇体积分数95%为宜。

图1 乙醇体积分数对卵磷脂得率的影响

2.1.2 料液比

由图2可知，料液比1∶2.0～1∶2.5 g/mL时，芸豆卵磷脂得率和料液比呈正相关，料液比1∶2.5 g/mL时，白芸豆皂苷得率达到最大值。溶剂用量继续增加时得率降低，说明过高和过低的料液比并不能使卵磷脂的得率明显提高，因此，选择料液比1∶2.5 g/mL为宜。

图2 料液比对卵磷脂得率的影响

2.1.3 超声时间

由图3可知，超声时间30～50 min时，芸豆卵磷脂的得率随提取时间的增加而呈现上升趋势，超声时间50 min时，芸豆卵磷脂的得率达到最大值，之后卵磷脂得率开始下降。分析原因可能是适当的超声时间会有利于卵磷脂分子的溶出，而超声时间太长会造成卵磷脂构型破坏，使得芸豆中卵磷脂凝集沉淀，从而影响芸豆卵磷脂的溶出，因此，选择50 min为优化超声时间的中心条件。

图3 超声时间对卵磷脂得率的影响

2.2 响应面法优化分析

在单因素试验基础上，利用Design-Expert 7.1.6程序进行响应面分析，进行芸豆卵磷脂提取工艺的优化。提取试验设计因素及水平见表1。Box-Behnken试验结果见表2。试验数据进行多元回归分析和最小二乘法拟合，以卵磷脂得率Y值作为响应值，以乙醇体积分数（A）、料液比（B）和超声时间（C）为自变量，建立回归方程：Y=20.430 7+1.013 5B-0.230 9A+0.551 6C-0.143 5B2-1.782 2A2-2.304 2C2-0.145 5AB-0.012 0BC-0.510 2AC，删除不显著因素后，方程简化为Y=20.430 7+1.013 5B-1.782 2A2-2.304 2C2-0.510 2AC。

表2 Box-Behnken试验设计及结果

表3和表4方差分析显示，芸豆卵磷脂提取工艺参数回归模型的P值＜0.05，达到显著水平（P＜0.05），且失拟项P值=0.051＞0.05，不显著，方程与试验拟合度较好，可用于芸豆卵磷脂提取的分析与预测。回归方程各项方差分析表明，3个影响因素对芸豆卵磷脂得率影响的大小顺序依次为料液比＞超声时间＞乙醇体积分数。其中，乙醇体积分数和超声时间交互项对回归模型影响显著。

表3 以得率为响应值的回归方程方差分析及显著性检验

表4 方差分析

2.3 提取工艺的响应面分析与优化

响应面图可以直观地反映出各因素及其交互作用对芸豆卵磷脂得率的影响[9]。坡度越陡峭且颜色变化越剧烈，说明因素之间交互作用越明显。图4显示，料液比（B）对芸豆卵磷脂得率的影响显著。乙醇体积分数（A）和超声时间（C）对芸豆卵磷脂得率的影响不显著，但乙醇体积分数（A）和超声时间（C）交互作用影响显著。从响应面分析图可以找到最佳参数及各参数之间的关系[9]。根据响应面分析得到最佳工艺参数：乙醇体积分数95%，料液比1∶2.434 35 g/mL，超声时间51.313 min。芸豆中卵磷脂得率的理论预测值为20.932%。

图4 2个因素交互作用对得率的影响

2.4 验证试验

通过响应面法优化分析各因素对芸豆卵磷脂得率的影响，在乙醇体积分数95%，料液比1∶2.434 35 g/mL，超声时间51.313 min条件下理论得率最高，但考虑到实际操作的局限性，将实际提取工艺条件修正为乙醇体积分数95%，料液比1∶2.4 g/mL，超声时间51 min。在修正条件下进行3次重复验证试验，检测结果吸光度为0.432。经过验证，响应面分析的优化结果与实际值较吻合，误差在允许范围内，说明采用Box-Behnken组合设计优化得到的芸豆卵磷脂得率工艺参数准确可靠，具有一定应用价值。

3 结论

在单因素试验基础上，采用响应面设计对试验条件进行优化，响应面法优化提取工艺克服正交法不能研究因子与因子之间、因子与响应值之间相互关系缺陷[9]。获得的微波辅助提取芸豆卵磷脂的最佳提取工艺为乙醇体积分数95%，料液比1∶2.4 g/mL，超声时间51 min。在3个提取因素中，对芸豆卵磷脂影响情况为料液比＞超声时间＞乙醇体积分数。在此优化工艺下，芸豆卵磷脂的得率可达20.932%。试验优化微波辅助芸豆卵磷脂的提取工艺，为芸豆卵磷脂的开发与利用提供一种简单、快速的提取方法。