IL-15与NK细胞在不明原因复发性流产中的临床意义

谷秀霞，林宁，戴凌，李晓红，赵琳

(南京医科大学附属苏州科技城医院妇产科，江苏 苏州 215000)

复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)在临床指妇女妊娠期出现连续两次或超过两次的自然流产现象，是育龄期女性较易见病症之一，而导致RSA产生原因与父母染色体存在异常、内分泌严重失调、子宫内膜感染及子宫的结构存在异常等有关，且这些原因在RSA中占40%～50%；而其余50%～60%的RSA原因还未明确。在患者再次妊娠期间出现自然流产风险较大时临床统称不明原因复发性流产(unexplained recurrent abortion，URSA)，严重影响女性生殖健康[1-2]。绒毛膜促性腺激素β(human chorionic gonadotropin-β，HCG-β)与孕酮是临床评估产妇是否存在先兆流产风险的常规指标，其中HCG-β为胎盘滋养层的细胞分泌而得糖蛋白类激素，有效保持产妇黄体，并减少产妇淋巴细胞相关功能对胎儿造成排斥反应，是女性妊娠期特异性标志[3]；孕酮为妊娠早期机体必需的孕激素，具有显著生物活性，其能减少妊娠期产妇子宫遭受外界刺激敏感度，继而降低子宫收缩现象[4]。但近年来研究[5]发现，HCG-β与孕酮水平易遭到诸多因素影响，使得鉴别诊断价值欠佳。因此，临床学者对寻找更具诊断价值的指标十分关注。自然杀伤(natural killer，NK)细胞为人体防御体系的首层屏障，NK细胞具备机体监视功能，通过分泌大量细胞因子及细胞毒性免疫等途径产生免疫调节[6]。白细胞介素-15(Interleukin-15，IL-15)被认为是维持NK细胞在机体中存活、增殖及分化所必需的细胞因子[7-8]。对于外周血IL-15与NK细胞的相关性临床研究尚少。本研究拟观察URSA患者的外周血IL-15与NK细胞亚群水平的改变，并分析其检测临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2019年12月就诊于南京医科大学附属苏州科技城医院妇产科计划生育门诊及妇科门诊的URSA患者57例为研究对象(观察组)；并选取同期入院体检，且无不良孕产史的健康早孕者57例为对照组。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。对照组纳入标准：(1)既往有生育出足月且健康的胎儿；(2)早孕等临床反应均正常。观察组纳入标准：(1)通过排除性诊断筛查[9]，排除如子宫解剖结构因素、患者血栓前状态、遗传因素、内分泌因素、感染因素、免疫因素及其他不良因素等病因，无法确定上述病因的复发性流产患者，且已完善妇科相关检查；(2)既往出现超过两次自然流产症状；(3)夫妻双方未出现染色体异常；(4)患者及其家属均知情同意。排除标准：(1)自身存在免疫性相关病症；(2)伴发心肝肾等重大疾病；(3)遗传性病症；(4)合并其他严重病症；(5)临床相关资料不齐等。本研究已获得南京医科大学附属苏州科技城医院医学伦理委员会批准，所有患者对研究内容知情同意。

1.2 方法

全部的受试者在检查的前1 d天饮食保持少盐、少脂肪，维持睡眠充分且均禁烟酒；于此日的清晨空腹采集8 mL的静脉血，在2 000 rpm下离心15 min，并放置-80 ℃待测。

ELISA检测血清IL-15、孕酮、HCG-β、TNF-α、VEGF和CCL5水平：酶联免疫分析仪(型号：AMR-100/100T；厂家：杭州奥盛)检测血清IL-15(型号：YY-Es-11497；厂家：德国IBL)、孕酮、HCG-β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)及趋化因子配体5(CCL5)(均购自武汉赛培生物)水平。实验步骤严格按照操作说明书进行操作。

流式细胞仪检测外周血单个核细胞(PBMC) NK细胞亚群：(1)FICOLL密度的梯度分离法对外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)进行提取，选用无热源的人淋巴细胞分离液(含葡聚糖、蒸馏水及泛影葡胺成分，厂家：美德太平洋生物)制作出1～2×106个/mL细胞悬液；(2)超净台在进行实验前30 min实施紫外消毒，低温待检分离液放置到室温温度后再行实验，室温需控制低于24 ℃，全部标本需于3 d里完成检测；(3)流式细胞仪(型号：EPICS-XL；厂家：美国Beckman Coulter公司)对PBMC悬液里NK细胞亚群(CD56+CD16+、CD56+CD16-、CD56-CD16+)(试剂盒货号：BNCC339975；厂家：北京北方伟业计量技术研究院)检测。流式细胞仪实验步骤：取一定量细胞(约1×106个/mL)，直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应，孵育20～60 min后，用PBS(pH7.2～7.4)洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。(4)BD FACSAnto软件进行自动化质量控制，选择 BD FACSDiva软件获得10 000个细胞，前向角散射光(forward scatter,FSC)对细胞碎片的干扰进行排除，用FSC/SSC图以圈出所检淋巴细胞，通过散点图对细胞亚群比例加以分析，最后再用BD FACSDiva软件进行计算。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组观察组与对照组年龄、体重指数(BMI)、体重、孕囊大小、孕周、染色体异常占比、黄体功能不全占比、内分泌异常占比、吸烟及酗酒比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，观察组子宫异常占比、高凝状态占比高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组血清孕酮、HCG-β及IL-15水平比较

观察组血清孕酮及HCG-β水平低于对照组，IL-15水平高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组孕酮、HCG-β及IL-15水平比较

2.3 两组NK细胞水平比较

观察组CD56+CD16+型NK细胞水平高于对照组，CD56+CD16-与CD56-CD16+型NK细胞低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组NK细胞亚群比较

2.4 外周血IL-15与NK细胞各个亚群水平的相关分析

外周血IL-15水平和CD56+CD16+型NK细胞水平呈正相关性(r=0.560，P<0.05)；和CD56+CD16-、CD56-CD16+型NK细胞水平呈负相关性(r= -0.641、-0.571，P<0.05)。见图1。

2.5 外周血IL-15与NK细胞诊断URSA效能

外周血IL-15与NK细胞的三种亚型比例对URSA的发生均有诊断学价值(AUC=0.680～0.927，P<0.05)；4个指标联合诊断的AUC可达到0.942，高于任意一项指标的单独诊断效能(Z=6.524、16.325、11.700、6.052，P<0.05)。见表4。

表4 外周血相关指标诊断URSA效能

2.6 血清TNF-α、VEGF与CCL5水平比较

观察组血清TNF-α、VEGF、CCL5水平高于对照组(P<0.05)。见表5。

表5 两组TNF-α、VEGF与CCL5水平比较

3 讨论

RSA患者在妊娠12周前，便能产生腹痛与阴道流血等症状，通过超声等检查可见患者胚胎发育低于正常孕周，其妊娠囊有所变形，未见胚芽，伴随妊娠囊的位置朝下移动，呈现无原始心血管的搏动等影像学相关表现。诸多患者可能仅表现月经量异常增多或推迟。胎儿在母体中能被识别成同种异体的移植物，因其具有约50%父系相关遗传物质，在母体中当作移植受体，可发挥出非我以及自我识别免疫系统的功能[10-11]。考虑到URSA病因较复杂，其出现和机体免疫相关指标存在紧密关系，故而通过分析免疫相关因素在URSA病发期间的作用对确定患者发病机制并进行尽早预防至关重要。基于此笔者对URSA患者的外周血IL-15与NK细胞亚群水平的改变进行观察，发现伴随外周血IL-15水平提升，NK细胞的毒活性随之增多，继而引发患者流产症状。

有研究[12]发现，在正常女性不同的月经周期检测子宫内膜皆存在IL-15表达，而子宫内膜里IL-15含量RSA患者更高，且IL-15变化和临床常规检查具备相似检测结果。本研究中URSA患者孕酮与HCG-β水平低于正常产妇，而IL-15水平高于正常产妇，提示通过孕酮与HCG-β水平异常与否可确定患者是否存在流产风险，而IL-15在母胎界面出现异常表达和自然流产存在相关性。分析原因可能是在正常妊娠时IL-15适量表达能有效维系妊娠期间免疫系统的平衡性，但IL-15呈现过量表达可能对胎儿与滋养层细胞造成细胞毒相关效应，使机体免疫受损，对患者胚胎顺利着床与后续发育产生影响，从而导致流产症状。NK细胞来源至今尚未完全确定，常认为其直接由骨髓所衍生，且其在淋巴结与骨髓里的表达远少于外周血，是机体中固有的一类免疫系统细胞，其活化无需通过抗原的刺激，能直接产生细胞毒相关效应，可在人体中发挥抗肿瘤、病原菌的杀灭等重大功效[13]。妊娠早期NK细胞会分泌诸多细胞因子，并参与子宫内胎盘的小血管重塑，继而对女性正常妊娠加以保护。NK细胞CD56+CD16-型可保护并在胚胎的发育期间提供营养；适量的CD56-CD16+型可抵御女性妊娠期间出现微生物的感染，而过量则能对其胎儿造成排斥反应；CD56+CD16+型能激活细胞的毒效应，产生非特异性的靶细胞杀伤能力；当这三类亚型失衡时，杀灭妊娠相关有害物质的同时，对胚胎产生排除伤害，导致妊娠失败[14]。本研究中观察组CD56+CD16+型NK细胞水平高于对照组，观察组CD56+CD16-与CD56-CD16+型NK细胞水平低于对照组。说明CD56+CD16+型数量异常增加，CD56+CD16-与CD56-CD16+型异常减少，继而导致URSA。正常妊娠期间，杀伤性的抑制受体水平提高，能阻挡杀伤信号的传递，使NK细胞的杀伤功能关闭，继而有效维持妊娠；当NK细胞的毒性增加时，会致使妊娠失败的不良结局出现。

T淋巴细胞为机体免疫耐受中关键性介质，依照其表面不同分化簇，可分成抑制性的T细胞与辅助性Th细胞，而Th细胞又因所介导功能不同分Th1与Th2细胞亚群，IL-15归属于Th1型的细胞因子，IL-15为NK细胞的特异性促成熟因子，临床可见NK细胞上存在IL-15受体表达[15]。有研究[16]证实，肿瘤的发生期间NK细胞活化主要由IL-15反式信号所转导的细胞影响，其触发NK细胞约8 h至外周血，进而到达机体肿瘤组织的相应部位，再由其余活化信号产生协同作用来构成效应细胞。本研究显示，URSA患者外周血IL-15水平和NK细胞CD56+CD16+型呈正相关性，和CD56+CD16-、CD56-CD16+型负相关性；外周血IL-15与NK细胞联合检测诊断URSA效能最优。提示IL-15水平随着NK细胞CD56+CD16+型水平的上升而增加，IL-15与NK细胞联合检测有助临床URSA疾病诊断和鉴别。可能是因IL-15表达增加致使NK细胞中能激活细胞毒活性的CD56+CD16+型增多，引发机体免疫过量激活，导致免疫耐受异常，进而致使患者流产等不良妊娠结局。肿瘤发展期间NK细胞能通过内识别法对机体细胞活化进行直接识别，通过IL-15等直接接触因子或TNF-α等能溶性因子传递信号到机体NK细胞，使其发挥炎性因子分泌以及杀伤功效[17]。

女性孕早期血清IL-15水平能对NK细胞的增值产生促进，继而使NK细胞生成包含TNF-α在内的一系列相关炎症因子，在妊娠早期TNF-α能促进产妇能量代谢、降解细胞的外基质以及维系黄体功能，通过调节机体滋养层细胞来影响血清孕酮、HCG-β等激素水平[18-19]。而妊娠期NK细胞可产生VEGF等生成血管的前因子，能对血管的重塑构成诱导，形成产妇胎盘区域的血管，继而为产妇与胎儿供给血液[20]。同时，NK细胞能分泌CCL5等趋化因子，而此类趋化因子能利用自分泌以及旁分泌有效调控机体免疫活性以及滋养层细胞功能，进而产生妊娠的免疫耐受，使妊娠成功[21]。本研究显示，观察组血清TNF-α、VEGF、CCL5水平高于对照组。提示TNF-α参与机体滋养层细胞浸入及分化等功能的调节，流产症状产生可能和TNF-α、VEGF与CCL5水平增加相关。临床可通过辅助诊断NK细胞下游介质TNF-α、VEGF、CCL5水平变化为早期诊断URSA提供参考。分析原因TNF-α的高表达令母胎界面的免疫失衡，进而介导机体排斥胚胎细胞相关免疫反应，并对子宫的平滑肌相关组织产生兴奋，引发子宫收缩，进而使胎盘的滋养层处血管遭受损伤，产生炎症血栓，继而对胚胎的植入以及发育形成阻碍；而VEGF水平异常会影响胎盘的绒毛血管正常生长，导致产妇流产；CCL5能募集许多活化Thl型淋巴细胞到蜕膜，而这些活化Thl型细胞会再分泌CCL5，形成级联增大的作用，继而产生免疫效应，其水平上调导致母胎界面Thl型水平的紊乱，导致产妇出现自然流产。

综上，外周血IL-15与CD56+CD16+型NK细胞水平呈正相关，检测外周血IL-15水平高表达及NK细胞亚群明显失衡可作URSA有效诊断指标。但本研究由于病例数较少，具有局限性，仍需更多样本检测加以证实。