马铃薯组培脱毒技术在生产中存在的问题和解决方法

包永佶

（1.威海市农业科学院，山东 威海 264200；2.威海市薯类脱毒技术重点实验室，山东 威海 264200）

0 引言

植物组培技术是未来农业工厂化育苗的重要发展方向[1]。其具备独特的优点：一是不受外界气候因素影响，不受时间限制，一年四季均可进行繁殖生产[2]；二是不受空间制约，场所可按照生产规模进行规划；三是技术运用广泛，可运用到多种植物的脱毒、快繁、保存和育种中[3-4]；四是能带来可观的经济效益。

我国马铃薯的种植面积已经稳居全世界第一[5]。马铃薯的组培脱毒技术日臻成熟，近20年脱毒种苗的繁育推广在生产实践中的应用得以快速发展[6]。剥离的茎尖经3至6个月的培养后，通过马铃薯病毒检测，获得了脱毒试管苗。对脱毒试管苗继代培养，获得大量优质试管苗，形成了工厂化生产。

南方马铃薯种植业受气候和地理位置影响，曾需用火车从北方运输原种，解决种薯病毒、病害的问题。随着组培脱毒技术的推广，现使用组培脱毒技术，在本地就可获得脱毒优质种薯。

1 马铃薯组培脱毒技术存在的问题

组培脱毒技术虽然很成熟了，但是在人为操作过程中，仍然存在很多问题。

1.1 植物培养基配置中出现的问题

在植物组培技术中，植物培养基是植株成活所需营养成分的来源，是植株生长的基础。马铃薯的培养基普遍使用MS培养基。在配置MS培养基的时候，传统做法是按照大量元素、微量元素等营养成分，分门别类进行配置[7]，由于配置的母液需要放置在冰箱中，有时候会出现母液发生沉淀和变质而导致基础培养基发生问题的情况。目前，由于硝酸铵、硝酸钾药品的购买程序比较复杂，很多药品厂家直接按照MS培养基成分表生产成品，这样省去了各种药品称量配置的过程，在生产上操作极为方便。但是出现了另一个问题，不同厂家生产的不同批次的MS培养基在使用过程中，会出现差异。笔者以相同的操作在更换了一次产品后出现了马铃薯试管苗生长异常的现象，如图1所示。

图1 马铃薯试管苗生长异常现象图

通过观察，笔者发现更换MS培养基药品厂家后马铃薯试管苗出现异常，表现出马铃薯试管苗增粗、扭曲现象，换回原MS培养基后异常消失。

1.2 组培技术操作中出现的污染问题

组培的整个操作过程需要在无菌环境中进行，污染程度的大小成为马铃薯组培生产整体成败的决定因素，污染来源也是在生产操作过程中产生的[8]。

1.2.1 培养植株的容器清洁不彻底，引起污染

盛放培养基的容器，以试管或玻璃瓶、塑料容器为主，以及和其相配的密封盖。容器的清洁是重要的工作，在清洗过程中，操作者不认真，对瓶壁、盖子上粘黏的污物处理不彻底，忽视了细微之处的洁净，也可能引起后续培养基的污染，导致试管苗的遗弃。

1.2.2 培养基灭菌不彻底，引起污染

将配置好的培养基分装到容器后，需进行高温高压灭菌。如果在高温高压灭菌时，设置的温度、压力、处理时间没有按照要求设定，使灭菌未达到标准，就会导致培养基灭菌不彻底。在长期生产中也可能忽视了灭菌锅密封圈的更换，长期使用导致密封圈老化，灭菌漏气，也达不到培养基彻底灭菌的要求，导致培养基的污染。

1.2.3 操作者操作不当，引起污染

在超净工作台上的操作是植物组培技术的重要操作环节。操作者没有严谨的态度，不严格按照无菌操作程序，均可能导致试管苗的污染。常见的操作失误有：配置的消毒酒精度数没有达到70%～75%的浓度，达不到消杀目的；操作前，未对操作室及操作台做整体紫外灯和酒精喷杀等灭菌操作；操作者没有更换衣服、佩戴口罩；操作者手部碰触试管苗、剪子、镊子或者瓶口、瓶盖等部位，对剪子、镊子等物件没有严格在火苗上消杀灭菌；长期使用超净工作台，忽视了对其初效过滤器和高效过滤器的清洁和更换。

1.2.4 培养室不洁净，引起污染

组培技术中对培养室环境的洁净度要求很高。转移扩繁后的试管苗时，虽有培养容器的密封盖，但仍然不是真空的。所以在空气污浊、环境脏乱差的培养室中培养，污染是不可避免的。如果组培试管苗在培养室中培养时间过长，就会导致试管苗污染。一般情况下，马铃薯在25 ℃左右的培养室，生长20 d左右就可以进行下一次的扩繁操作了。

1.3 组培苗在驯化中发生的问题

马铃薯组培试管苗最终在达到预期数量后，要进入日光温室进行微型薯的生产。笔者培育的组培试管苗是在恒温、高湿和弱光环境下培育生长的，进入温室，彻底改变了原有的生长环境，所以要对试管苗进行驯化，也就是炼苗。

马铃薯和其他植物相比，它的试管苗相对更娇嫩一些，在驯化过程中，打开培养瓶时间过快、突然增大光照强度、突然降低湿度等不当操作，都会引起试管苗在短时间内发生萎蔫，降低试管苗的成活率。

1.4 日光温室管理不当出现的问题

驯化后的马铃薯试管苗移栽进入日光温室的管理极为重要。这个阶段是微型薯生产的最后关键点。日光温室前期的准备工作不足，忽视防虫网的安装，会导致外来性虫害的发生；忽视温室杀菌和消毒工作，苗床和基质不做消杀，后期温室培育的薯苗会滋生病虫害；基质配制不合理，在移栽驯化苗后，会返苗困难；驯化苗成活后，缺乏定期的施肥，会导致马铃薯苗营养匮乏，出现黄叶、不健壮等症状；也有操作者主观认为脱毒苗，无菌无病，忽视温室苗期的病害预防，使得脱毒微型薯感染马铃薯病害，失去了脱毒种薯的意义。

2 马铃薯组培脱毒技术问题的解决方法

2.1 认真配置，杜绝培养基异常

针对培养基选择问题，尽量选择大的药品厂家，先行购买小量MS培养基，严格按照说明配制培养基，小量转移马铃薯试管苗，观察10 d以后，如果没有发生试管苗异常现象，就可以放心进行大规模的继代扩繁或其他用途的培养基配制，避免因更换生产厂家或者批次，导致培养基不同引起试管苗的异常。

2.2 遵守操作规则，减少污染

2.2.1 认真清洗，洁净容器

严格清洗容器，对于污渍严重和已经污染的器皿和密封盖，清洗之前，在高温高压灭菌锅中进行正规灭菌，然后再取出进行洗涤。目前，由于人工费用的增加，很多马铃薯种苗企业通过使用机器洗瓶子来降低成本。在此建议，在使用机器清洗容器之前，应用适量的消毒剂浸泡容器，使用0.1%的84消毒剂或洁尔灭，效果更佳。

2.2.2 熟悉设备，设置正确

购买高温高压灭菌锅后，按照使用说明，正确设置温度、压力和处理时间。及时更换即将老化的灭菌锅密封圈，也要定期进行灭菌测试。将灭菌后的培养基在接种室闲置3 d，观察是否有污染现象。如果培养基正常就可进行正常转苗等操作。

2.2.3 严格操作，减少污染

严格按照要求操作植物组培技术的每个步骤环节。消毒酒精按照75%的浓度进行配制，减少95%酒精挥发浓度不足带来的隐患；操作前，对操作室及操作台进行紫外灯照射30 min，用75%酒精对操作室和操作台进行喷杀，做空气喷雾降尘；操作者操作前进行手部清洁，可佩戴一次性手套，用75%酒精灭菌；操作者更换衣服、佩戴口罩，操作时候不必要不说话和走动；对剪子、镊子等物件定期在灭菌锅进行消毒，操作时位置严格定位于火苗前上方，注重操作细节；定期对超净工作台的初效过滤器和高效过滤器进行清洁和更换，确保仪器的正常使用。

2.2.4 保持环境洁净，避免后期污染

常年保持培养室的清洁，保证光照、温度、湿度的数值在合理正常范围内。进出培养室快进快出，定期对培养室进行灭菌。通常使用移动臭氧紫外灯，一个月进行一次30 min的臭氧消杀，能保障培养室处于相对无菌状态。对马铃薯试管苗20 d左右进行一次继代扩繁操作，缩短培养时间，既能保证试管苗的健康生长，又能保障不增加试管苗培养的成本。

2.3 循序渐进，提高试管苗成活率

马铃薯试管苗的驯化要循序渐进。当需要移栽的试管苗生长到5 cm～7 cm的时候，开始驯化。先将需要移栽的试管苗带着瓶子转移出培养室，瓶盖不动，在具备自然光的环境中培养3 d，使弱光下生长的试管苗慢慢适应光照相对强的自然光。第4 d，拧松瓶盖，让培养瓶内的空气和外界空气适度流通，使试管苗慢慢接触培养瓶以外的空气。第5 d，彻底揭开瓶盖，试管苗暴露在自然环境中，但是此时的环境湿度要保证在85%以上，如果达不到，就要在中午光照温度较高的时候，对空气进行喷雾，增加湿度。避免直射强光，棚顶覆盖遮阳网。第7 d以后即可从瓶中取出试管苗，轻轻清洗掉苗根部的培养基，剪去长根，保留1 cm～3 cm长度的根，用0.1%浓度的高锰酸钾或者百菌清等杀菌剂浸泡试管苗几分钟后取出，进行移栽定植。

2.4 完善日光温室，加强日常管理

对于生产马铃薯微型薯的日光温室，要充分做好前期的准备配制工作，完善温室设施[9]。选择安装60目的防虫网；对温室和苗床进行杀菌和消毒，杀灭隐藏的菌类和虫卵；配制配方合理的基质，提前做好基质消杀，浸透基质，移栽驯化苗。目前，很多马铃薯种薯生产企业选择椰糠作为基质，椰糠因透气性、保湿性好成为马铃薯脱毒试管苗温室育苗的新宠，如图2所示。

图2 马铃薯脱毒试管苗温室育苗图

但是由于椰糠中含有高盐分，在使用之前要进行清洗盐分的工作。笔者尝试用浸泡清洗3～4遍的方法，如图3所示，使椰糠基质中的盐分含量低于0.2%。基本达到了马铃薯育苗的要求。大型育苗企业拥有比较先进的自动化温室，驯化苗的成活率都较高。笔者在这里用简易温室做了2年的试验，试管苗在椰糠基质中的成活率获得了100%的好效果。简易温室长20 m，宽2.5 m，最外层覆盖有遮阳网，温室侧面由60目防虫网围绕。将驯化苗移栽到椰糠基质上，选用碳纤维细管在温室内搭建了一个小拱棚，拱棚外覆盖塑料膜，提高驯化苗生长的湿度。

图3 浸泡清洗图

驯化苗进入温室后，前7 d的苗期管理尤为重要，一方面要保障温室的湿度达到85%以上，另一方面要做好遮阳管理。驯化苗成活后，悬挂粘虫板。约20 d左右，开展喷施肥料和病害预防等正常管理。

80 d以后可视不同品种的成熟期进行微型薯的采收。本文试验的普通基质微型薯，同一品种的单株结薯在2～3颗，采用椰糠基质后，获得微型薯，单株结薯达到5～7颗的成绩。

3 结语

综上所述，要提升马铃薯组培脱毒技术水平，环环相扣，专注每一个步骤的细节，克服因人为操作带来的污染损失，真正把握好马铃薯组培脱毒技术，通过生物技术在生产中提高马铃薯质量和产量[10]，充分发挥其应有的作用。