基于基因组选择分析解析中国美利奴羊（OAR2）脱毛症的遗传规律

李亮，胡登林，罗鹏辉*，杨会国

（1.新疆维吾尔自治区畜牧总站，乌鲁木齐 830000；2.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830000）

绵羊是人类最早驯养的家畜种类，我国先后从澳大利亚、新西兰、南非等引进了不同的绵羊品种，且在不断引进、变化中[1]。据《中国畜禽遗传资源志·羊志》统计，我国一共有71个绵羊品种，其中42个地方品种，21个培育品种，8个引入品种。众多绵羊品种为我国今后的绵羊育种工作、基因挖掘等科技研究提供了良好的基础条件。

绵羊基因组一共27对，其中26对常染色体，1对性染色体。2004年美国、新西兰、英国的科学家公布了第三代高密度的绵羊遗传连锁图[2]。绵羊基因组学是开展绵羊分子遗传标记研究应用的基础[3]。选择性清扫是在全基因组水平上通过扫描家养动物群体在驯化过程所受正向选择的基因区域或分子标记[4]，家畜在历史驯化和品种培育及改良过程中已经受到了强烈的人工和自然选择，在家畜的基因组上留下了选择信号。

细毛羊脱毛症，病程为1～3个月，发病率高，死亡率低，病羊体温偏低；羊毛无光泽，毛质粗糙，营养不良，还会出现啃食被毛等异食癖，进入干草期后，羊毛质量更差，大量灰尘粘附在表皮，变为黄土色，皮肤粗糙，弹性差，最终导致羊毛质量下降和减产，造成极大的经济损失。为了找出细毛羊脱毛症的病因，全球各国的科研人员都在努力，但始终无法确定病因。而且相关研究大多停留在表面。由于病因复杂，一般将其简单分为以下几个方面：寄生虫病（疥螨和痒螨）；营养代谢病（缺乏硫及含硫氨基酸或锌元素或铜元素等）；传染病（绵羊痘和山羊痘等）；皮肤真菌病等。

多年以来，防治细毛羊脱毛症的方法一般为：在饲料中添加缺少的营养元素或者投放矿物质缓释丸，定期驱虫和使用抗生素等。但是这些防治手段效果差且多有反复，带来许多不必要的麻烦，造成巨大的人力、物力和时间上的损失。在此情况下，从基因入手研究细毛羊脱毛症是一个不错的选择，因ORA2存在绵羊生长选育相关分子标记，受人工选择强度大。存在更强的基因印迹，因此本研究将挖掘和分析中国美利奴羊OAR2上与脱毛症有关的QTL。

在绵羊方面，Moradi等[5]基于Ovine SNP50 BeadChip对两种不同类型的绵羊脂尾品种进行基因组件的选择信号分析，发现肥尾绵羊在OAR5和OARX有QTL重叠区域，瘦尾绵羊在OAR7有QTL重叠区域。Huihua Wang等[6]基于Ovine SNP50 BeadChip对三个绵羊品种（Mongolian fat-tailed，German Mutton Merino，African white Dorper）进行基因组选择信号分析，获得APOBP和GTO为身体指数相关的候选基因，ALDOA为肉质性状候选基因，EDAR是羊毛性状候选基因，MSRB3影响耳型大小等。Guan Wang[7]等通过对小尾寒羊和藏羊的心肌、骨骼肌、脾脏和肾脏基因表达的研究，发现在藏绵羊OPA1和MIC60基因表达高于小尾寒羊。王维民[8]基于绵羊重测序的方法，利用藏羊、阿尔泰羊、多浪羊、湖羊和蒙古羊的基因数据进行分析比较，发现位于22号染色体上22.425-22.575Mb的选择区域内，存在已报道参与调控在血液中血红蛋白水平和红细胞数量及高海拔红血球增多症相关的CYP17基因，还发现多浪羊的2号染色体上53.1-53.25Mb区域内的DNAJB5基因，该基因能提高细胞对热应激原的耐受性。

虽然传统的育种方法在动物育种工作中的确实取得了一些成果，但其局限性也很明显，它无法准确指明各个基因的功能，而且人工干预的程度低，无法在早期进行选种，缩短世代间隔，育种的结果也不稳定。很明显这种费时费力并且结果不稳定的育种技术已经不能够满足现代畜牧业的育种要求，而分子遗传学和动物分子育种技术为此提供了新的解决办法。

QTL是影响数量性状的一个染色体片段[9]，包含决定某个数量性状的基因或微效基因簇。它可以借助遗传标记和统计分析来确定性状与基因的关系。这一现象为动物的育种技术升级提供理论依据。目前，Animal QTLdb数据库中已经收录了大量畜禽的QTL，其中猪有25 610个，鸡有7 812个，牛有99 652个，羊有1 658个，并且还在不断收录新的QTL，为未来精确研究单个基因效应做好基础工作，以推动分子育种技术发展。

羊是我国主要的经济动物之一，与羊毛相关的产业在我国经济发展中也非常重要，而我国羊毛生产现状无论是数量还是质量都无法满足相关产业的需求，其中细毛羊脱毛是一个重要原因。对绵羊QTL研究开发是利用遗传资源最快的方法之一，但是细毛羊脱毛症QTL的研究报道却很少，因此这项工作非常必要。

综上所述，对于中国的绵羊品种出现脱毛症的问题，在基因水平上的认识十分有限。本研究拟从绵羊基因组芯片选择性清扫分析的方法入手，考虑到OAR2分子标记丰富，遗传物质多样，因此进行OAR2的挖掘及其分析，为细毛羊脱毛症基因水平上的防治提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

在伊犁库克图拜种畜场，随机挑选150只中国美利奴羊，分为病例组（50只）和健康组（100只）。样品病理情况调查时间为2006年至2016年。

1.2 耳组织采集

用剪耳钳在耳缘处剪下一黄豆大小的组织块，去除掉组织块上的毛和杂物，置于己灭菌的1.5 mL离心管中，编号后放入采样冰盒，送往实验室，保存于-70℃的冰箱。

1.3 样品DNA提取

粉碎耳组织，采用氛氯仿法进行DNA提取。由生物公司进行Ilumina Ovine SNP50 BeadChip制备，再由BeadScan Software软件将图像进行转换，形成数据信号，然后我们再利用Genome Studio软件对基本的数据结果进行处理，Plink1.07软件将其转换为MAP和PED文件。

1.4 基因型检测

筛选生物技术公司提供的数据和SNP等位基因频率分析，舍弃非目标SNPs位点。用Plink1.07软件对其进行质量控制：排除样品中检出率低于95%的单体样品。同时，排除质量不合格的SNPs，检出率低于90%、最小等位基因频率低于5%、哈代-温伯格平衡检验P值低于1×10-6的SNPs。

1.5 Fst检测

本研究中，根据无偏估计Fst方法计算留下的SNP位点，获得两个群体的每个SNP位点的群体分化指数Fst值[10]。计算公式如下：

MSG为检测的群体内部位点的误差均方：

MSP是检测的群体之间位点的均方差：

校正后的群体间平均样本大小：

上述公式中，i是总亚群数S的一个群体，i=1，2，3，4…S；PAi是第i个亚群中SNP等位基因A的频率；ni是亚群体i的平均样本大小；PA是各群体中PA的加权平均值，即

本研究的Fst数据计算基于（http：//www.r-project.org/）R语言pegas软件包完成，画图基于R语言ggplot软件包完成。

2 结果与分析

用分光光度计来检测所提取的耳组织DNA的浓度和纯度，浓度大于50 ng/μL，纯度OD260/OD280在1.7～2.0之间，OD260/OD230应介于1.8～2.1之间。用0.8%的琼脂糖凝胶，验证所提取的耳组织基因组DNA。

如图1所示，琼脂糖凝胶电泳检测的条带清晰带型完整，点样空干净无污染没有拖尾现象。可以说明所作电泳检测的DNA没有被蛋白污染，没发生降解，其检测质量合格，满足高密度基因组芯片制备的条件。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

经过PLINK提取2号染色体，共获得5 470个，经过质量控制后获得SNPs 3 125个。对该染色体利用vcftools软件对病例组和健康组进行基因组选择信号分析，通过Fst计算，将所对应1% SNPs阈值以上的位点为有意义的分子标记。共获得31个分子标记，对其进行基因功能注释，获得相关基因51个(表1，图2)，通过查阅文献和基因功能分析，其中有7个和脱毛症相关，分别是ADAM29、CTLA4、LPL、RPL21、NR4A2、TMEFF1、ICOS（表2）。

表2 脱毛症相关候选基因及其主要功能

图2 健康和脱毛症绵羊全基因组分化系数分析（Fst）曼哈顿图及OAR2上Fst值分布情况

表1 在2号染色体上健康和脱毛症绵羊全基因组选择信号分析（Fst≥0.247）

续表

3 讨 论

本研究通过对中国美利奴羊脱毛症在OAR2上进行选择信号分析，共获得有意义的分子标记31个，经过基因功能注释，获得相关基因51个。中国美利奴羊脱毛症在基因因素提供分子标记，为以后中国美利奴羊健康选育提供分子理论支撑，通过选择育种后，使得中国美利奴羊向着疾病少，产毛好的方向发展。细毛羊脱毛症给全世界的细毛羊羊毛产业带来极大的经济损失，但是对于细毛羊脱毛症在基因组水平研究报道较少。不同的疾病或营养都会引起绵羊免疫系统下降导致脱毛症现象的产生，因不同个体绵羊的免疫系统受到父本和母本影响，在这种遗传形式下，因免疫系统下降导致出现脱毛症的个体，将会发病，引起发病的原因主要受环境和基因共同决定。环境层面主要是集中在疾病、寄生虫、营养等因素，而对于基因组层面的研究较少，本论文正是通过基因组层面对绵羊脱毛症的现象进行分析，从而获得和脱毛症相关的分子标记。经过基因组选择信号分析，我们一共找到了7个脱毛症相关的候选基因，它们分别是ADAM29、CTLA4、LPL、RPL21、NR4A2、TMEFF1、ICOS。

ADAM29是ADAM（解整合素和金属蛋白酶）基因家族中的一个，以前已经证明它在食管癌中具有重要影响，根据最新调查结果显示，超过15%的黑素瘤病例中发现它的突变，在人类疾病中，黑素瘤病因免疫力下降，导致出现脱发等现象。ADAM29中鉴定突变子集的功能分析显示出它们增加了黑色素瘤细胞与对胶原蛋白I，II和IV的粘附，这表示他们的确是黑色素瘤的启动因素[11]。

CTLA4是白细胞分化抗原，是T细胞上的受体，与CD28共享B7分子配体，当CTLA4与B7分子结合后，诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。人CTLA4的细胞外结构域和人IgG1的Fc部分的片段组成CTLA4Ig，这是一种可溶性嵌合蛋白。它与抗原呈递细胞（APC）上的B7-1和B7-2分子结合，阻断CD28介导的共刺激信号，以进行T细胞活化[12]。CTLA4通过与B7结合抑制T细胞活性，造成自身免疫疾病，由此引发包括卵巢、食管、肠道、皮肤等全身多处的病变，根据研究显示，斑丘疹、瘙痒、牛皮癣、皮疹、天疱疮、皮肌炎、斑秃、苔藓样反应、白癜风、结节病、指甲和口腔粘膜病变等多种皮肤问题都与CTLA4有关[13～15]。

LPL是脂蛋白脂肪酶基因，但是最新研究发现，它可以通过影响抗氧化酶的表达水平，影响细胞衰老，对真皮成纤维细胞的修复造成影响[16]。

RPL21基因编码核糖体蛋白L21，它是60S亚单位的组分。L21由160个氨基酸残基组成，属于L21e家族。它位于细胞质中，是核糖体结构的一部分。核糖体蛋白L21的功能分析表明，它与白内障和结直肠癌有关[17，18]。此外，RPL21可能与遗传少毛症有关[19]。

NR4A2编码的产物可以导致极化T细胞不能进一步分化成成熟Th17细胞，进而导致无法产生IL-21和IL-17，IL-17A特异性抗体在人类银屑病，葡萄膜炎和类风湿性关节炎的临床试验中是有效的[20]。

TMEFF1编码的跨膜蛋白，在其细胞外区域含有两个卵泡抑素结构域和一个表皮生长因子样结构域。TGF-β信号能够激活干细胞分化成为毛囊，虽然对TMEFF1蛋白质知之甚少，但是霍华德休斯医学研究所已经证明了TMEFF1是TGF-β信号的直接靶基因并且在Telogen→Anagen转变中的毛发表达[21]。

ICOS编码的蛋白质是CD28和CTLA-4细胞表面受体家族中的一员。它能够形成同源二聚体，参与信号之间的信号传导，免疫应答和细胞增殖调节。能够引起自生免疫疾病，从而引发银屑病等皮肤问题，在皮肤伤口愈合等方面起到了关键的作用[22]。

4 结 论

本研究对中国美利奴羊2号染色体进行基因组选择信号分析，经过基因组注释获得7个和脱毛症相关的基因ADAM29、CTLA4、LPL、RPL21、NR4A2、TMEFF1、ICOS。本研究结果，为中国美利奴羊的品种保护提供参考，为绵羊脱毛症的育种选择提供分子标记，也为绵羊健康养殖提供参考。