营养条件对水虻油脂积累的影响

乔红皓，王秋晨，武传良，蔡珉敏，黄 凤，张吉斌，喻子牛，郑龙玉

(华中农业大学，湖北 武汉 430070)

亮斑扁角水虻(HermetiaillucensL.,black soldier fly,BSFL)，属于双翅目(Diptera)、水虻科(Stratiomyidae)、扁角水虻属昆虫[1]。其幼虫营腐食，具有食量大、抗逆性强、生物转化效率高等特点[1]，能够将畜禽粪便进行无害化处理[2]，并资源化形成高质量昆虫蛋白饲料和油脂原料用于开发生物柴油，为构筑新型的绿色、循环、可持续产业体系提供了新思路，具有重要的现实意义[3]。水虻可回收利用废弃营养，在短时间内就能快速合成占生物质干重至少35%的油脂[4-6]；前期研究利用水虻油脂开发了生物柴油，其密度、黏度、闪点和十六烷值等各项指标都满足国际柴油标准(EN14214)[6]。由于水虻具有脂肪含量高、油脂积累快、转化效率高、生长周期短等优点，所以从营养层面揭示水虻油脂积累的影响机制有助于优化水虻的生产性能，是实现水虻油脂大量定向积累的重要基础。

对昆虫营养条件的研究一般集中在单个营养物质(如碳水化合物或蛋白质)上[7]，也有利用几何框架(GF)来研究营养物质相互作用的影响[8]。对于那些成虫是非摄食的昆虫，碳水化合物和蛋白质是影响它们生存、生长和繁殖的最重要的营养物质[9-10]，因此，碳水化合物和蛋白质的比例(C∶P值)是影响这些昆虫营养条件的一个重要因素。目前，大多数关于可消化碳水化合物和蛋白质之间的平衡及其对昆虫性能的影响研究主要集中在蚱蜢、毛虫、甲虫幼虫、蚜虫和螳螂[11-12]。不同物种由于生活史、发育甚至性别的不同，其最佳C∶P值也有所不同[11]。具有氮代谢共生菌的昆虫(如蚜虫和蟑螂等)对C∶P值的需求最低[13]；繁殖阶段的最佳C∶P值不一定适用于生长阶段[14]；田间蟋蟀成虫在高蛋白(C∶P=1∶3)条件下的体重和卵产量达到最大，雄性和雌性成虫的寿命分别在C∶P值为3∶1和8∶1时最长[15]；雄性和雌性黑腹果蝇在寿命达到最长和繁殖最佳时所需的C∶P值也存在很大差异[16]。

营养条件对水虻生长发育有一定影响[17]，目前，对亮斑扁角水虻营养条件的研究多针对已知成分的天然饮食。2017年，Cammack等[18]研究了人工饲料(C+P=42%)不同C∶P值(1∶5、1∶1、5∶1)对水虻生长特性的影响，发现在C∶P值为1∶1时存活率最高。饲料中营养物质对水虻生长非常重要，即使C∶P值相差很小也会显著影响水虻的生长特性[19-20]。基于此，作者通过改变人工培养基中碳水化合物和蛋白质的含量及C∶P值，探究营养条件对水虻生长发育和油脂积累的影响，为深入研究水虻油脂积累的影响因素、提升畜禽粪便及餐厨剩余物等有机废弃物的资源化利用效率、实现废弃物向绿色能源的高效转换提供理论支撑，进而助力我国未来能源保障[21]。

1 实验

1.1 材料

水虻种群：亮斑扁角水虻(HermetiaillucensL.)幼虫，武汉品系，采集武汉野生品种在华中农业大学微生物农药国家工程研究中心饲养繁衍驯化得到，种群稳定。

人工饲料：将麸皮和小麦次粉以质量比1∶1混合，加水搅拌，调整为相对含水率为65%的基础饲料，按基础饲料与碳水化合物质量比为1∶ 0.4加入碳水化合物配制成人工饲料。麸皮和小麦次粉均从市场购买。

1.2 人工培养基的配制

在玻璃瓶中加入适量的去离子水、葡萄糖、琼脂、酵母提取物和无机盐，置于微波炉中加热至琼脂全部溶解，取出，待温度下降，加入适量复合维生素、干酪素、纤维素、胆固醇、亚油酸等，充分搅拌，冷却后使用。

人工培养基配方：琼脂2 g、酵母提取物1 g、无机盐600 μL、复合维生素303.33 mg、胆固醇366.67 mg、亚油酸370 μL。其中无机盐母液(1000×)配方为：250 g·L-1CaCl2·6H2O 100 μL、2.5 g·L-1CuSO4·5H2O 100 μL、25 g·L-1FeSO4·7H2O 100 μL、250 g·L-1MgSO4100 μL、1 g·L-1MnCl2·4H2O 100 μL、25 g·L-1ZnSO4100 μL，以上试剂均为国药集团化学试剂有限公司产品。

改变碳水化合物和蛋白质的含量，按表1配制不同C∶P值的人工培养基。

1.3 实验水虻的饲养

首先用收卵盒收集新鲜的水虻虫卵，然后放入孵化盆，在收卵盒上方盖上一层湿润的双层纱布同时在孵化盆上方覆盖双层纱布；大约3～5 d后，收集水虻幼虫转移到塑料盆中，加入人工饲料，用双层纱布封住塑料盆口，置于温度为(28±2) ℃、相对湿度为60%的温室中饲养，每天根据幼虫的进食情况添加人工饲料，直至6～8日龄，备用。

表1 不同C∶P值的人工培养基配方

1.4 粗脂肪的测定

称取烘干的水虻虫粉(m0，约1～5 g)，用滤纸包裹后置于(105±2) ℃烘箱中烘至恒重(m1)；取出，放入索氏提取器的提取管中，在平底烧瓶中加入100 mL石油醚和玻璃珠，连接仪器各部分，并接入水管，通入冷凝水，用一小团脱脂棉塞入冷凝管中，调节水浴温度为70～80 ℃，提取至管内的滤纸上无油滴为止；然后用长镊子取出，置于通风处30 min使石油醚挥发；再置于(105±2) ℃烘箱中烘至恒重(m2)。按下式计算水虻的粗脂肪含量(%)：

1.5 三酰甘油的测定

称取适量新鲜水虻幼虫，按料液比1∶9(g∶mL)加入无水乙醇，冰水浴条件下机械匀浆，2 500 r·min-1离心10 min，取上清液。在96孔板中的空白孔中加入蒸馏水2.5 μL、工作液 250 μL；在标准孔中加入标准品2.5 μL、工作液250 μL；在样品孔中加入上清液2.5 μL、工作液250 μL。参照甘油三酯测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书测定三酰甘油含量。

1.6 粗蛋白的测定

采用凯氏定氮法测定粗蛋白含量。称取1 g左右水虻虫粉，加入一片凯氏定氮催化片、10 mL浓H2SO4进行加热消化，然后用K9840型海能自动凯氏定氮仪测定水虻氮含量，进而计算水虻粗蛋白含量。消化程序为：240 ℃，1 h；420 ℃，2 h；冷却至室温。

1.7 脂肪体的染色和观察

选取新鲜老熟水虻幼虫少许，挑取脂肪体，用1×PBS轻轻漂洗3次，置于4%多聚甲醛中固定30 min；再用1×PBS轻轻漂洗3次，每次5 min；将脂肪体转入工作浓度为1 μg·mL-1的Nile-Red染液中，室温避光孵育10 min；再用1×PBS轻轻漂洗3次，每次5 min，避光操作；将脂肪体转入工作浓度为1 μg·mL-1的DAPI染液中，室温避光孵育10 min；再用1×PBS轻轻漂洗3次，每次5 min，避光操作。

将染色后的脂肪体置于载玻片上，加10 μL抗荧光猝灭封片剂，轻轻盖上载玻片后用指甲油进行封片，置于避光的组织孵育盒中；在尼康STORM超分辨共聚焦显微镜下观察荧光信号，并拍摄照片。蓝色信号代表细胞核，红色信号代表脂滴，激光波长分别为405 nm和561 nm。利用尼康共聚焦软件统计分析脂肪体脂滴的直径。脂类物质以脂滴形式主要分布在脂肪体中，脂滴直径和荧光强度与脂肪体中的脂质含量呈正相关关系。

1.8 脂肪酸相对含量的测定

称取水虻虫粉0.1～10 g(精确至0.1 mg，约含粗脂肪100～200 mg)，置于250 mL平底烧瓶中，加入25 mL石油醚，浸提；提取完毕，将平底烧瓶中的液体移至分液漏斗中，用50 mL石油醚冲洗烧瓶，冲洗液并入分液漏斗中，加盖，振荡5 min，静置10 min；将醚层提取液并入到250 mL平底烧瓶中，按以上步骤重复提取3次，最后用石油醚冲洗分液漏斗，并入到250 mL平底烧瓶中，旋转蒸发浓缩至干，残留物即为水虻脂肪提取物。

在脂肪提取物中加入2%氢氧化钠甲醇溶液8 mL，连接回流冷凝器，(80±1) ℃水浴回流，直至油滴消失；从回流冷凝器上端加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液，(80±1) ℃水浴继续回流2 min；用少量水冲洗回流冷凝器；停止加热，取下平底烧瓶，迅速冷却至室温；加入10～30 mL正庚烷，振摇2 min；加入饱和氯化钠水溶液，静置分层；吸取上层正庚烷提取液约5 mL，移至25 mL试管中，加入3～5 g无水硫酸钠，振摇1 min，静置5 min，取上层溶液于进样瓶中，按色谱条件测定水虻脂肪酸相对含量。

色谱条件：强极性毛细管色谱柱DB-WAX(20 m×0.18 mm，0.18 μm);进样器温度270 ℃，检测器温度280 ℃;程序升温：初始温度100 ℃，保持6 min；100～180 ℃，升温速率10 ℃·min-1，保持6 min；180～200 ℃，升温速率1 ℃·min-1，保持20 min；200～230 ℃，升温速率4 ℃·min-1，保持10.5 min;载气为氮气，分流比100∶1，进样量10 μL。检测条件应满足理论塔板数(n)至少2 000，分离度(R)至少1.25。

2 结果与讨论

2.1 不同碳水化合物对水虻预蛹体重和粗脂肪含量的影响

分别以葡萄糖、果糖、麦芽糖、淀粉为碳水化合物，加入到基础饲料中饲养水虻，考察不同碳水化合物对水虻预蛹体重和粗脂肪含量的影响，结果如图1所示。

图1 不同碳水化合物对水虻预蛹体重和粗脂肪含量的影响Fig.1 Effect of different carbohydrates on prepupa weight and crude fat content of BSFL

由图1可知，与对照组相比，在基础饲料中加入葡萄糖、果糖、麦芽糖时水虻预蛹体重增加，加入淀粉时预蛹体重变化不大；且加入葡萄糖时的预蛹体重最重，达到了(0.256±0.010) g，明显高于对照组(0.226±0.009) g和淀粉组(0.230±0.004) g。与对照组相比，在基础饲料中加入葡萄糖、果糖、麦芽糖时水虻粗脂肪含量增加，分别为40.0%±1.0%、40.4%±0.4%、40.1%±0.1%；而加入淀粉时水虻粗脂肪含量(34.1%±0.4%)与对照组(34.2%±0.6%)相差不大，远低于加入葡萄糖、果糖、麦芽糖时的粗脂肪含量。故，选取葡萄糖作为人工培养基的碳源进行后续实验。

2.2 不同C∶P值对水虻粗脂肪、三酰甘油和粗蛋白含量的影响

以葡萄糖为碳源配制不同C∶P值的人工培养基饲养水虻，测定水虻粗脂肪和三酰甘油的含量，绘制碳水化合物含量与蛋白质含量交互作用对水虻粗脂肪、三酰甘油和粗蛋白含量影响的响应面图，结果如图2所示。

图2 碳水化合物含量与蛋白质含量交互作用对水虻粗脂肪含量(a)、三酰甘油含量(b)、粗蛋白含量(c)影响的响应面图Fig.2 Response surface plots for effect of interaction between carbohydrate content and protein content on crude fat content(a)，triacylglycerol content(b),and crude protein content(c) of BSFL

由图2a可知，在低碳水化合物(C<50%)条件下，水虻粗脂肪含量随人工培养基中蛋白质含量的增加逐渐增加；在高碳水化合物(C≥50%)条件下，粗脂肪含量主要受到碳水化合物含量的影响，蛋白质含量对粗脂肪含量影响不大，如在碳水化合物含量为50%时，蛋白质含量分别为25%、50%时的粗脂肪含量分别为40.4%±0.6%、38.9%±0.1%，相差不大。在低营养低碳水化合物(C+P=25%，C∶P=1∶4)条件下，粗脂肪含量为20.8%±0.3%；而在高营养高碳水化合物(C+P=100%,C∶P=4∶1)条件下，粗脂肪含量为52.1%±0.6%。

由图2b可知，在低碳水化合物条件下，增加蛋白质含量，水虻三酰甘油含量相应增加；在高碳水化合物条件下，增加蛋白质含量，三酰甘油含量相应减少，而且几乎不受碳水化合物含量增加的影响。在低营养(C+P=25%)、C∶P值为1∶2的条件下，三酰甘油含量最低，为(162.090±6.907) mmol·L-1；而在高营养(C+P=75%)、C∶P值为4∶1的条件下，三酰甘油含量最高，为(272.091±5.731) mmol·L-1。

由图2c可知，在蛋白质含量相同的情况下，水虻粗蛋白含量随碳水化合物含量的变化趋势与粗脂肪含量的变化趋势(图2a)相反。在低碳水化合物条件下，水虻粗蛋白含量随人工培养基中蛋白质含量的增加逐渐增加；在高碳水化合物条件下，蛋白质含量对粗蛋白含量影响较小。本实验条件下，水虻粗蛋白含量最高可达到51.2%±0.2%，最低为35.6%±0.5%。

碳水化合物含量与蛋白质含量交互作用对水虻粗脂肪含量和粗蛋白含量影响的方差分析见表2。

表2 碳水化合物含量与蛋白质含量交互作用对水虻粗脂肪含量和粗蛋白含量影响的方差分析(F=1,df=59)

2.3 不同C∶P值对水虻脂肪体脂滴的影响

脂滴是细胞内中性脂肪(neutral lipids)的主要贮存场所，广泛存在于细菌、酵母、植物以及动物细胞中。脂滴直径能够一定程度上反映水虻的脂肪积累情况。分别在低营养低碳水化合物(C+P=25%，C∶P=1∶4)、低营养高碳水化合物(C+P=25%，C∶P=4∶1)、高营养低碳水化合物(C+P=100%，C∶P=1∶4)、高营养高碳水化合物(C+P=100%，C∶P=4∶1)等4种营养条件下饲养水虻，在STORM超分辨共聚焦显微镜下观察水虻脂肪体脂滴形态，结果如图3所示。

a.C+P=25%，C∶P=1∶4 b.C+P=25%，C∶P=4∶1

水虻脂肪体脂滴(红色)和细胞核(蓝色)的染色情况可以直观反映水虻脂肪积累情况。由图3可知，在C+P=25%、C∶P=1∶4条件下，水虻脂肪体脂滴几乎不可见，荧光强度低，黑色区域面积大，说明在低营养低碳水化合物营养条件下水虻几乎不积累脂肪；在C+P=25%、C∶P=4∶1条件下，可以看见少许的脂滴；在C+P=100%、C∶P=1∶4条件下，脂滴较为密集；而在C+P=100%、C∶P=4∶1条件下，脂滴明显增多、增大，荧光强度高。表明，高营养高碳水化合物营养条件下，由于高碳水化合物的存在，水虻可以积累较多的脂肪。在C+P=25%、C∶P=1∶4，C+P=25%、C∶P=4∶1，C+P=100%、C∶P=1∶4，C+P=100%、C∶P=4∶1营养条件下，水虻的粗脂肪含量分别为20.8%±0.3%、25.3%±0.6%、34.1%±0.3%、52.1%±0.6%。

2.4 不同C∶P值对水虻脂肪酸相对含量的影响

在不同营养条件下饲养水虻，采用GC-MS测定水虻的脂肪酸相对含量，结果见表3。

表3 不同营养条件下水虻的脂肪酸相对含量/%

由表3可知，在水虻中共检测到10种脂肪酸，其中月桂酸、棕榈酸、油酸是主要的脂肪酸，它们的相对含量较高，且几乎不受人工培养基营养浓度和C∶P值的影响。月桂酸作为一种中链脂肪酸对包括金黄色葡萄球菌、幽门螺旋杆菌等多种病原菌有杀灭作用，不仅可以作为动物日粮中常规的能量来源替代品，而且能够替代用于预防和管理胃肠道疾病的饲料抗生素；棕榈酸属于饱和脂肪酸；油酸属于单不饱和脂肪酸，具有降血糖、调血脂、降胆固醇、保护心脏等作用。棕榈酸+油酸组合代替月桂酸+肉豆蔻酸组合可能具有治疗血栓的作用。提高人工培养基的营养浓度可以增加十三烷酸的相对含量，但肉豆蔻酸、十五烷酸、十七碳烯酸、硬脂酸的相对含量则减少，特别是肉豆蔻酸，在人工培养基营养浓度较低(C+P=25%)的情况下，相对含量为10.0%左右，而在营养浓度较高(C+P=100%)的情况下，几乎检测不到肉豆蔻酸。

2.5 不同C∶P值对水虻其它指标的影响

以不同C∶P值的人工培养基饲养水虻，测定水虻的存活率、单重及干物质量，结果见表4。

表4 不同营养条件下水虻的存活率、单重及干物质量

由表4可知，以不同营养浓度、不同C∶P值的人工培养基饲养水虻，水虻的存活率均在90%以上，表明水虻的抗逆性较强，能够适应不同的生活环境。在低营养浓度(25%)下，随着人工培养基中蛋白质含量的增加，水虻的单重和干物质量整体逐渐增加；在高营养浓度(100%)下，随着人工培养基中碳水化合物含量的增加，水虻的单重和干物质量整体逐渐增加。实验还发现，随着人工培养基营养浓度的升高，水虻到预蛹的时间也会延长。

3 结论

通过测定水虻预蛹体重、粗脂肪含量、三酰甘油含量、粗蛋白含量、脂滴形态、脂肪酸相对含量，研究了水虻在不同营养条件下的脂肪积累情况。结果表明：(1)葡萄糖、果糖、麦芽糖均能促进水虻粗脂肪的积累，粗脂肪含量分别达到40.0%±1.0%、40.4%±0.4%、 40.1%±0.1%。(2)响应面分析表明，在低碳水化合物(C<50%)条件下，增加人工培养基中蛋白质含量能够促进水虻粗脂肪的积累；在高碳水化合物(C≥50%)条件下，水虻粗脂肪的积累主要受到碳水化合物含量的影响；当C+P=100%、C∶P=4∶1时，水虻粗脂肪含量达到52.1%±0.6%；当C+P=25%、C∶P=1∶4时，水虻粗脂肪含量则降至20.8%±0.3%;不同营养条件下，水虻粗蛋白与粗脂肪的积累趋势相反。(3)水虻脂肪的积累同样会影响其体内脂肪酸的相对含量。月桂酸、棕榈酸、油酸是水虻生物质衍生的主要脂肪酸，其相对含量几乎不受人工培养基营养浓度和C∶P值的影响。营养浓度的提高会使十三烷酸的相对含量增加，使肉豆蔻酸、十五烷酸、十七碳烯酸、硬脂酸的相对含量减少。特别是肉豆蔻酸，在营养浓度较低时，肉豆蔻酸的相对含量为10.0%左右；而在营养浓度较高时，几乎检测不到肉豆蔻酸。本研究为水虻脂肪的高效积累提供了一定的理论基础。