油菜素内酯对低温胁迫下冬小麦 wrab17基因表达的影响

王璐瑶，刘丽杰,2，丁美云，孙玉婷，于梦迪，张东向,2，李珊珊,2，金忠民,2

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室，黑龙江齐齐哈尔 161006)

黑龙江省地处中国高寒地区，几乎没有越冬作物，寒地冬小麦品种东农冬麦1号(Dn1)是中国首例能在黑龙江省高寒地区安全越冬(返青率>85%)的强抗寒性(可耐-30 ℃低温)品种，可与大豆等作物进行套种，不仅可解决作物重茬问题，使产量增加，还可改变黑龙江省长期以来1年1熟的种植制度，实现2年3熟制，提高土地利用率和粮食生产率，有利于黑龙江省种植业的可持续发展。

基因属于第3组LEA(LEA3)基因家族，参与冬小麦抗寒调控。编码的蛋白包含166个氨基酸，其中有9个氨基酸突变率较高，与赤霉素诱导的蛋白ES2A有84%的同源性，可响应低温、脱落酸和赤霉酸的诱导，在小麦所有器官中均有表达。基因编码的蛋白具有高度亲水性，可在干旱和低温胁迫下保护细胞膜的稳定性，减轻干旱和低温胁迫造成的伤害。前人研究表明，大豆、水稻、棉花、葡萄、大麦和小麦中存在不同的基因家族成员。

油菜素内酯(brassinolide，BR)是一种具有高活性的无毒的类固醇激素，可控制细胞分裂、植株营养生长、种子萌发等生理过程，广泛参与植物的逆境响应过程。BR在植物体内含量极低，但其生理活性却极高，极低浓度的BR就可以对植物产生明显的影响。研究表明，BR在植物响应非生物胁迫过程中起正向调控作用，外源喷施一定浓度的BR可增强植物对冷冻胁迫和盐胁迫的耐受性。但目前有关BR对冬小麦抗寒基因表达的影响还未见报道。因此，本研究对Dn1中的基因进行克隆，利用生物信息学对wrab17蛋白进行分析，并通过qRT-PCR技术分析BR处理对低温胁迫下Dn1中基因表达量的影响，探究基因调控Dn1的抗寒机制，以期为探索冬小麦在高寒地区安全越冬提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为寒地冬小麦品种东农冬麦1号(Dn1)，由齐齐哈尔大学生命科学与农林学院植物代谢生理实验室提供。

1.2 材料处理

选择大小一致、饱满的小麦种子，于2020年9月播种于齐齐哈尔大学试验田，株距5 cm，行长1 m，行距20 cm，正常田间管理。于小麦三叶期在叶片上喷施BR(0.1 mg·L)，对照组喷施蒸馏水，连续10 d日最低温度平均值为5 ℃、0 ℃、-10 ℃、-25 ℃时，对冬小麦分蘖节和叶片进行取样，用双蒸水进行清洗，擦干分装，液氮速冻后置于-80 ℃保存。

1.3 RNA的提取及cDNA第一条链的合成

利用Trizol法分别提取小麦叶片和分蘖节的总RNA。利用微量紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，并进行琼脂糖凝胶电泳，检验RNA的完整性，RNA合格后置于-80 ℃保存。以叶片和分蘖节的总RNA为模板，使用PrimeScriptRT reagent Kit(TaKaRa，大连)合成cDNA第一链，置于-20 ℃冻存。

1.4 目的基因的克隆

从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得小麦基因的全长序列(Genebank登录号：AF255053.1)。利用Primer Premier 5设计特异性引物wrab17-F/R(表1)，以小麦分蘖节cDNA为模板，利用Premix Taq(RR003A)(TaKaRa，大连)进行PCR扩增，PCR扩增体系和扩增程序均按照说明书进行，退火温度为60 ℃。利用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，利用胶回收试剂盒(景新，杭州)进行凝胶回收，利用DNA连接酶将目的基因连接到pMD18-T载体(TaKaRa，大连)上，并将连接产物导入大肠杆菌感受态DH5α中，利用菌落PCR检测阳性单克隆，利用质粒提取试剂盒(索莱宝，北京)提取质粒，然后送上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

表1 本研究用到的引物信息

1.5 wrab17蛋白的生物信息学分析

利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的基本理化性质。利用Expasy-protscale(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白的亲疏水性。利用TMPred(https://www.expasy.org/resources/tmpred)预测蛋白的跨膜区域。利用SingleP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)预测蛋白的信号肽。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)预测蛋白的二级结构，并利用Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)预测蛋白的三级结构。利用MEGA 5.0软件构建小麦与其他10种植物的 wrab17蛋白进化树，利用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对这些物种的蛋白序列进行比对。

1.6 wrab17基因的表达量分析

根据基因的cDNA序列设计qRT-PCR引物wrab17-2F/2R，以为内参基因，按照TB Green Premix Ex Taq试剂盒(TaKaRa，大连)说明书反应体系进行qRT-PCR。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。利用2-ΔΔt法计算基因的相对表达量，3次生物学重复，用SPSS软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 wrab17基因的克隆结果及其序列分析

以Dn1 cDNA为模板，利用特异性引物wrab17-F/R进行PCR扩增，从图1可以看出，可扩增出500 bp左右的条带(图1)。经NCBI分析表明，冬小麦基因的全长为735 bp，其中开放阅读框为500 bp，可编码166个氨基酸。

M：DL2000；1～4：PCR扩增产物。

2.2 wrab17蛋白的生物信息学分析

2.2.1 wrab17蛋白的基本理化性质分析

ProtParam分析表明，wrab17蛋白的分子式为CHNOS，相对分子质量为 17 160.71 Da，属于稳定蛋白，稳定指数为 22.59，理论等电点(pI)为4.85。wrab17蛋白的氨基酸组成中，丙氨酸的含量最高，占比 17.5%；表面带负电荷的氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)残基有28个，表面带正电荷的氨基酸(精氨酸+赖氨酸)残基有20个，平均亲水系数为-0.807。

2.2.2 wrab17蛋白的亲疏水性、跨膜区、信号肽以及二三级结构分析

Expasy-protscale软件分析表明，wrab17蛋白的亲水性指数为0.956，疏水性指数为-2.078，为疏水性蛋白(图2A)。TMPred在线软件分析表明，wrab17蛋白无跨膜区(图2B)。SingleP 5.0软件分析表明，wrab17蛋白不存在信号肽(图2C)。用SOPMA对wrab17蛋白的二级结构进行预测，结果(图2D)显示，wrab17蛋白含有72.29%的α-螺旋，5.42%的延伸链，3.61%的β-转角和18.67%的无规则卷曲。进一步利用Swiss-model对 wrab17蛋白的三级空间结构进行预测，结果(图2E)显示，该蛋白的二级结构与三级结构相似。

A：wrab17蛋白的亲水性分析；B：wrab17蛋白的跨膜区检测；C：wrab17蛋白的信号肽分析；D：wrab17蛋白的二级结构；E：wrab17蛋白的三级结构。

2.2.3 wrab17蛋白的系统进化树分析及同源蛋白序列比对

利用MEGA 5.0构建小麦与二粒小麦()、硬粒小麦(subsp.Durum)、旱麦草()、冰草()、贵州悬竹()、柳枝稷()、粗山羊草()、高粱()、二穗短柄草()、蒙古冰草()wrab17蛋白的系统发育树(图3)，利用Clustal软件对上述植物wrab17蛋白的氨基酸序列进行比对(图4)。结果均表明，小麦与粗山羊草的wrab17蛋白亲缘关系最近；二粒小麦与硬粒小麦以及高粱、二穗短柄草与蒙古冰草的亲缘关系较近，而与小麦wrab17蛋白的亲缘关系较远。

图3 小麦与其他10种植物wrab17蛋白的系统发育树

图4 小麦与其他10种植物wrab17蛋白氨基酸序列的比对结果

2.3 低温胁迫对Dn1叶片和分蘖节中 wrab17基因表达模式的影响

从表2可以看出，随着温度的降低，Dn1叶片中基因的表达量在对照组和BR处理组均呈现先升后降的变化趋势，均在-10 ℃达到峰值，且两个处理之间无显著差异；Dn1分蘖节中基因的表达量在对照组和BR处理组均呈现“升-降-升”的变化趋势，分别在0 ℃和-25 ℃达到峰值，均显著高于5 ℃和-10 ℃的表达量。与对照组相比，BR处理提高了Dn1叶片中基因在5 ℃、0 ℃、-10 ℃的表达量，且在0 ℃时达到显著水平；提高了Dn1分蘖节中基因在5 ℃、0 ℃、-10 ℃、-25 ℃的表达量，且在0 ℃、-10 ℃、-25 ℃达到显著水平。

表2 BR对低温胁迫下Dn1叶片和分蘖节中 wrab17基因相对表达量的影响

3 讨 论

基因属于基因家族成员，在低温和干旱胁迫中发挥着重要作用，可保护生物大分子免受逆境的伤害。LEA蛋白最初是由Dure等在棉花中被发现，随后其在蕨类、藻类、苔藓类、小麦、玉米、水稻、油菜等植物中也被鉴定出来。研究表明，LEA3蛋白与植物的抗逆性有关。

本研究表明，基因在Dn1叶片和分蘖节中均有表达，但在不同温度下，Dn1叶片和分蘖节中基因的表达量有所不同。总体表现为叶片中基因在-10 ℃时表达量最高；分蘖节中基因在-25 ℃时表达量最高，且明显高于叶片中的表达量，说明在-25 ℃低温胁迫下，分蘖节更具有抗寒能力。这与于 晶等报道的分蘖节是决定高寒地区小麦安全过冬的重要器官相一致，也说明了基因与Dn1的抗寒性密切相关。

BR参与植物的低温胁迫，保护植物免受低温胁迫的伤害。前人研究表明，BR可改善低温胁迫下黄瓜和番茄的光合作用，从而增强黄瓜和番茄对低温的抗性。本研究结果表明，BR处理后可提高低温胁迫下Dn1叶片和分蘖节中基因的表达量，在5 ℃时Dn1叶片和分蘖节中基因的表达量在BR处理组和对照组之间差异均并不显著，而在0 ℃时差异均显著，初步预测Dn1中基因是在0 ℃开始对寒冷做出应答反应。而在-25 ℃时叶片中基因的表达量较低，而分蘖节中的表达量较高，这可能与叶片本身的抗寒能力有关，进一步证明了分蘖节具有更强的抗寒能力。BR处理组Dn1中基因的表达量高于对照组，也说明BR可提高Dn1的抗寒能力，对Dn1的安全越冬具有一定的促进作用。

总之，本研究从Dn1中克隆了基因，其编码的蛋白属于稳定蛋白，该蛋白无跨膜区和信号肽。-25 ℃时Dn1分蘖节中基因的表达量明显高于叶片中的表达量。BR处理正向调控基因的表达。本研究初步探究了基因在Dn1抗寒中发挥的功能，为BR参与低温调控提供了信息支持，也为小麦抗寒分子育种及栽培调控提供新思路，并丰富了耐寒基因资源。