单增李斯特氏菌能力验证结果与分析

文 白雯静 王艳炜 王海峰 . 兰州市食品药品检验检测研究院；.甘肃省陇神戎发医药股份有限公司

引言

单核细胞增生李斯特氏菌是普遍存在于自然环境中的革兰氏阳性、嗜冷、兼性厌氧细菌。同时，也是一种食源性的人畜共患病的病原菌，欧美国家曾多次暴发由于食用了受单增李斯特氏菌污染的肉制品、奶制品、蔬菜及水果等而引发的严重的食物中毒事件。在《GB 29921-2021 食品安全国家标准 食品中致病菌限量》中，对乳制品、肉制品（包括熟肉制品和即食生肉制品）、水产制品、即食果蔬制品、冷冻饮品均有五份样品中均不得检出单增李斯特氏菌（n=5，c=0，m=0）的规定；同样，在2022年3月7日实施的《GB 31607-2021 食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》中“部分或未经热处理散装即食食品”：单核细胞增生李斯特氏菌限量为0/25g（mL）。由此类标准可见，国家对于食品中“单核细胞增生李斯特氏菌”的管理是十分严格的。

目前，国内单核增生李斯特氏菌的检验方法主要有：分子生物学检测技术（结合等温扩增技术、结合聚合酶链式反应技术）、免疫学检测技术、生物传感器检测技术、光谱学检测技术、其它检测技术（除了基于核酸检测、特有蛋白检测之外，还可以与色谱、核磁等多项技术技术相结合对单增李斯特氏菌进行检测）。《GB 4789. 30-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌》与旧版标准相比较，主要增加了“第二法 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法”和“第三法 单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法”。目前，对单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法是比较成熟的。而且，随着检验检测技术日新月异的发展，使得较短时间内完成精准检测成为可能。

另外，对于实验室而言，质量控制具有十分重要的意义。质量控制的工作包括很多方面。比如，实验室内部控制和实验室间控制等等。实验室内部控制工作可通过多种工作方式来展开。比如，内部质量监督以及通过购买质控样品开展相关检验检测工作等等。但是，由于其实施的环境和主观等多种因素受限，仅有内部控制是远远达不到质量控制的要求。这时候，实验室可以通过多种方式来达到实验室间控制的目的。比如，参加外部能力验证就是一种十分常见且有效的形式。尤其针对微生物实验室，此项工作十分重要。微生物实验室可以通过参加能力验证、盲样测定以及比对试验等等。一方面，可以较大程度针对新入职人员提高其检验检测能力；另一方面，在一定程度上也反应了该实验室对“阳性样品”的检出能力。即保证“阳性”不漏检、阴性不得出现“假阳性”的结果。一旦实验室出现“假阳性”“假阴性”“与参考值范围不符”等情况时，实验室的负责人员应该针对整个实验室进行溯源。从人员、环境、设备、培养基和试剂等各个方面进行详细地追溯和分析，从而纠正不利因素，确保检验结果的科学性和准确性。

我院于2020年5月底参加了由中国食品药品检定研究院组织的“NIFDCPT-248 食品中单增李斯特氏菌检出能力验证”试验，按照后期返回的结果来看，检验结果为“满意”，现将具体试验情况汇报如下。

1.材料与方法

1.1 样品

实验室共收到2份单增李斯特氏菌样品，样品为白色球状、真空包装于西林瓶，样品编号分别为FC02220011、FC02220030；2袋奶粉样品，每袋重量为25g，编码与菌球编码对应。

1.2 仪器与材料

AC2-6S1型ESCO生物安全柜（新加坡艺思高公司）；GR-85致微高压灭菌器（厦门致微公司）；MJ-250-Ⅲ型霉菌培养箱（上海跃进）；HH.B11.600BY型恒温培养箱（上海跃进）；VITEK2 Compact 30型全自动微生物鉴定及药敏分析系统（法国梅里埃）；mini VIDAS（全自动荧光免疫分析仪）（法国梅里埃）。

李斯特氏菌显色培养基（批号：200309）、李氏增菌肉汤（批号：190401）、PALCAM培养基基础（批号：180425）均购于北京陆桥股份有限公司，所使用培养基均按照《GB 4789.28-2013 食品安全国家标准 食品微生物检验 培养基和试剂的质量要求》以及内部质控的要求进行验收与质控，并符合相关要求。VIDAS单增李斯特试剂盒（法国梅里埃）；VITEK2革兰氏阴性细菌鉴定卡（20卡）（法国梅里埃）。

李斯特氏菌Listeria monocytogenes［ATCC 19115］购买于美国菌种保藏中心，并定期采用国标的方法进行菌种鉴定和确认。

1.3 试验方法

在生物安全柜内分别开启西林瓶，将225 mL LB1增菌液加入到无菌均质袋中，并将西林瓶内小球加入到LB1增菌液中，充分溶解。然后将与西林瓶相同编码的奶粉样品加入到上述LB1增菌液中，充分均质混匀。依此方法，分别对2件样品进行平行处理。上述稀释液，于30℃培养24h后，移取0.1mL，转种于10mL LB2增菌液中，于30℃培养24h。取LB2二次增菌液划线接种于PALCAM琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基上，于36℃培养48h后,观察各个平板上生长的菌落；如有可疑菌落（典型菌落在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷），自选择性琼脂平板上分别挑取3-5个典型或可疑菌落，进行初筛试验和鉴定试验。取LB1增菌液按照miniVIDAS（全自动荧光免疫分析仪）仪器操作规程和试剂盒说明书进行相关试验。

2.结果与分析

2.1 mini VIDAS（全自动荧光免疫分析仪）快筛结果

按照VIDAS仪器要求：质控1（control 1）的示值须在0.71-1.07的范围内，质控2（Control 2）的示值须≤0.04；标准（standard）的示值须在2201-4801的范围内，方可进行后续样品试验，根据表1的试验数值，满足仪器要求，故可进行下部分样品的试验。

表1 VIDAS质控结果

取LB1增菌液按照mini VIDAS仪器操作规程和试剂盒说明书进行相关试验。结果如表2所示，根据表2结果，初步可判断样品FC02220030为阳性（检出单核增生李斯特氏菌），样品FC02220011为阴性（未检出单核增生李斯特氏菌）。

表2 VIDAS试验结果

2.2 PALCAM培养基和李斯特显色培养基培养结果

根据PALCAM培养结果和李斯特显色培养基培养结果来看，进一步确定样品FC02220030为阳性，样品FC02220011为阴性，结果如表3所示。

表3 PALCAM培养基和李斯特显色培养基培养结果

2.3 初筛/鉴定试验结果

参照《GB 4789. 30-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌》，对样品FC02220030进行初筛（接种木糖、鼠李糖发酵管）和鉴定试验（包括染色镜检、动力试验、过氧化氢酶试验等生化鉴定项目），确定FC02220030为阳性，具体结果如表4所示。

表4 FC02220030初筛/鉴定试验结果

单增李斯特氏菌（ATCC 19115）为阳性对照，其初筛和鉴定试验结果如表5所示。

表5 ATCC 19115（阳性对照）初筛/鉴定试验结果

2.4 VITEK2（全自动微生物鉴定及药敏分析系统）鉴定结果

表6为FC02220030 VITEK2鉴定结果：（99%概率），其置信度为极好的鉴定。

表6 FC02220030 VITEK2鉴定结果

3.讨论

通过对不同检验方法的分析，mini VIDAS在第一步增菌培养（即LB 1增菌液培养24h）后，便可进行试验，与常规检验方法结果一致，而且所需检验周期短，可在较短时间内得到结果。因此，该方法可用于大批量检品致病菌的快速筛查。另外，在李斯特氏菌显色培养基的制备过程中，应注意要将添加剂进行充分混匀，混匀后在加入培养基（培养基在高压灭菌121℃、15min后冷却至50℃备用）时，应注意边混匀边加入，以保证添加剂均匀地混合在培养基中，从而确保显色培养基质量的稳定性。另外，在配制操作时应注意无菌操作，否则容易导致没有白色晕圈或白色晕圈不明显，从而影响判定结果，造成假阴性的出现。另外，为确保试验结果，在配置显色培养基时，可以选择多个品牌的培养基进行对照和综合判断。最后，在试验的同时应注重阳性对照与阴性对照的使用，从而确保结果的可靠性与可追溯性。

在日常检验检测工作中，实验室应该制定详细的年度质量控制计划，通过能力验证、人员比对、质控样测定等多种方式，确保整个实验室正常、稳定地运行。另外，在涉及微生物致病菌的检验时，应采用多种仪器设备对结果进行比对和印证，进而确保实验结果的准确和可靠性。