草地贪夜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6和α7亚基基因克隆及其对乙基多杀菌素胁迫的响应

高祖鹏, 静大鹏, 黄晓丹,2, 王振营,*

(1. 中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193;2. 吉林农业大学生物防治研究所, 天敌昆虫应用技术工程研究中心, 长春 130118)

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda是一种原产于美洲热带和亚热带地区，具有迁飞能力强、寄主植物广、繁殖能力强等特点的重要农业害虫(郭井菲等, 2018, 2019a)。近年来随着国际贸易量的增加与人员频繁的流动为草地贪夜蛾从美洲大陆入侵非洲等洲提供了便利的途径，目前已逐渐蔓延至非洲、亚洲和大洋洲等国家和地区(CABI, 2019; Jingetal., 2020)。草地贪夜蛾于2019年1月初在我国云南省普洱市江城县首次被发现后，并迅速向周边地区和省份扩散为害，截止至2020年7月9日其已蔓延至我国21个省(市、区)1 029县(区)，已经对我国粮食安全构成了严重威胁(郭井菲等, 2019b; 王磊和陆永跃, 2020)。化学防治具有见效快、效果好、杀虫谱广等特点，尤其在害虫暴发期间的应急防控中的作用更加明显。我国农业农村部先后在2019和2020年推荐了用于草地贪夜蛾应急防治的药剂，最终确定并推荐了防治效果好的包括乙基多杀菌素在内的8种化学农药(梁沛等, 2020; Gaoetal., 2021)。而乙基多杀菌素作为多杀菌素的衍生品与多杀菌素类杀虫剂一样具有相同的作用靶标，即烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAchRs)(Salgado, 1998)。

烟碱型乙酰胆碱受体是由5个亚基对称排列而成是一种五聚体跨膜蛋白，其中包括了离子通道、激动剂/竞争性接抗性结合位点、具有调节离子通道功能的偶联机制、4个跨膜区(Badio and Daly, 1994; Corringer and Nicolas, 2000; Millar and Denholm, 2007)。根据胞内N端是否存在两个相连的半胱氨酸结构来判断nAchR家族：若存在，则为α亚基家族；反之，则为β亚基家族。近年来随着昆虫基因组测序的不断增加，根据已知昆虫的基因组序列，已发掘众多昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体基因，其中包含了鳞翅目、膜翅目、半翅目以及鞘翅目等重要农业昆虫。其中膜翅目的丽蝇蛹集金小蜂Nasoniavitripennis具有昆虫中最多的nAchR亚基类型，总共发现了16个nAchR亚基类型(Huangetal., 1999, 2000)。相反，脊椎动物的nAchR亚基家族要大得多，目前报告最多的为红鳍东方豚Fugurubripes，共计有27个亚基(Jonesetal., 2003)。此外，昆虫的nAchRs与脊椎动物的nAchRs相比，其主要分布在神经突触的前膜与后膜，与神经递质的释放与传递有关(Le Novèreetal., 2002)，因此备受众多农药研发者的关注。

nAchRs在昆虫神经递质传达中起着重要作用，是多杀菌素杀虫剂的重要靶标，但是目前对草地贪夜蛾nAchRs分子特性、功能及调控机制鲜有报道，且在基因组中对此基因未有注释。本研究基于前期已测得的草地贪夜蛾转录组数据，筛选出在乙基多杀菌素处理下差异表达的nAchR α6和α7亚基基因，采用RT-PCR以及RACE技术对nAchR α6和α7亚基基因进行克隆、测序和生物信息学分析，同时通过RT-qPCR技术分析草地贪夜蛾幼虫受到乙基多杀菌素胁迫后nAchR亚基α6和α7基因表达量的变化，可为后期研究草地贪夜蛾nAchR基因的功能及草地贪夜蛾抗药性的产生提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试虫

草地贪夜蛾初始种群于2019年1月采集于云南省德宏州芒市(24.42° N, 98.60° E)冬玉米田，在中国农业科学院植物保护研究所玉米害虫组于人工气候箱(上海一恒科学仪器有限公司，MGC-450HP-2)(温度26±1℃，相对湿度65%±5%，光周期14L∶10D)内饲养，利用夜蛾科通用人工饲料饲养(梁革梅等, 1999)，饲养期间不接触任何农药试剂。取饲养至F3代的幼虫用于实验。

1.2 试剂

乙基多杀菌素原药，由科迪华农业科技(上海)有限公司提供；二甲基亚砜(DMSO)、TRIzol®Reagent、丙醇和异丙酮，均购于北京星弦科技有限公司；TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Syethesis SuperMix试剂盒与LanGene®2×Fastlong PCR MasterMix，购于北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒，购于北京天漠生物科技有限公司；5′RACE试剂盒与3′RACE 试剂盒，均购于北京天恩泽基因科技有限公司；Pfu DNA聚合酶，购于Zoonbio公司；实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM)，购置于宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 总RNA的提取与cDNA合成

从草地贪夜蛾实验室品系中随机挑选3头3龄幼虫，采用TRIzol法提取总RNA，参照TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Syethesis SuperMix试剂盒说明书合成cDNA第1链，并放置于-80℃保存。

1.4 草地贪夜蛾nAchR α6和α7亚基基因克隆

本研究前期通过Blast等技术比对草地贪夜蛾转录组数据鉴定得到草地贪夜蛾nAchR α6和α7亚基基因编码区序列，基于亚基α6的完整开放阅读框(open reading frame, ORF)，设计引物(表1)nAchRsα6-F/R，对其序列进行扩增测序并验证。PCR扩增体系(40 μL): LanGene®2×Fastlong PCR MasterMix 20 μL, 上下游引物(10 mmol/L)各2 μL, cDNA 4 μL, PCR-Grad H2O 12 μL。PCR扩增程序: 94℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 54℃退火40 s, 72℃延伸120 s，共40个循环；最后72℃延伸6 min，4℃保存。

采用RACE克隆技术获得亚基α7基因全长序列。扩增体系与实验过程按照5′RACE 试剂盒与3′RACE 试剂盒说明书进行。该实验所用引物(表1)及测序工作均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.5 序列分析和系统发育树的构建

利用DNAMAN对测序结果进行碱基序列拼接及氨基酸序列推导。利用ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.gov/orffinder/)查找开放阅读框以及推测的氨基酸序列，并确认和DNAMAN的预测一致。通过NCBI-Blast(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索18个物种的nAchRs的同源氨基酸序列，总计81个氨基酸序列，并用MEGA5.1软件中的邻接法(neighbor-joining method)构建系统发育树，重复运行1 000次。

1.6 乙基多杀菌素胁迫后草地贪夜蛾幼虫nAchR α6和α7亚基基因表达量检测

根据本实验室前期毒力测定，首先将乙基多杀菌素原药用DMSO试剂溶解，后用含0.1% Tween-80蒸馏水稀释成0.400 mg/L的乙基多杀菌素溶剂(高祖鹏等, 2020)，采用表面涂抹法处理草地贪夜蛾3龄幼虫；以0.1%的Tween-80蒸馏水处理为对照组。处理48 h后选取存活的处理组和对照组幼虫各取3头为一个生物学重复用于总RNA提取，反转录合成cDNA备用。根据1.4节获得得到的草地贪夜蛾nAchR α6和α7亚基基因序列，利用Primer 3.0(https:∥bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在线设计qPCR引物(表1)，同时以草地贪夜蛾ribosomal protein S23 mRNA(GenBank登录号: AF400219.1)为内参基因，并设计引物进行qPCR检测(表1)。依据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行操作。qPCR反应体系: 5×UEIris II RT MasterMix 4 μL, dsDNase 1 μL, cDNA 1 μL, Nuclease-free H2O 13 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。qPCR反应程序: 95℃ 10 s; 95℃ 3 s, 60℃ 30 s; 95℃ 15 s, 共40个循环。处理组和对照组实验均采用3个生物学重复，4个技术重复。

1.7 数据分析

将实验所得数据利用2-ΔΔCT方法对草地贪夜蛾 nAchR α6和α7亚基基因的表达量进行分析(Mulleretal., 2002)。将Cq值采用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计分析，应用LSD法进行差异显著性检验。

2 结果

2.1 nAchR α6和α7亚基基因克隆和序列

克隆获得草地贪夜蛾nAchR α6亚基基因(GenBank登录号: MT951400)，开放阅读框长1 506 bp，编码502个氨基酸，并具有跨膜区域与信号肽，与甜菜夜蛾Spodopteraexigua的nAchR α6 isoform 3b8a(GenBank登录号: QIC53910.1)具有99.79%的氨基酸序列一致性。nAchR α7亚基基因(GenBank登录号: MW557608)开放阅读框长1 524 bp，编码508个氨基酸，并具有跨膜区与信号肽，与棉铃虫Helicoverpaarmieran nAchR α7亚基基因(GenBank：AJF23047.1)的氨基酸序列一致性97.24%。草地贪夜蛾的nAchR亚基α6和α7在胞内环具有半胱氨酸环结构(图1)，但是丽蝇蛹集金小蜂Nasoniavitripennis不存在该特征序列；且nAchR亚基α6和α7存在连续的12个氨基酸(RSSKSLLANVLD)，其中，第212和213位氨基酸为双C结构并具有4个跨膜区。由此可以看出草地贪夜蛾nAchR亚基α6和α7具有典型的烟碱性乙酰胆碱受体α家族的典型特征。

2.2 nAchR亚基α6与α7 系统发育

根据系统发育树与遗传距离分析结果可知，草地贪夜蛾nAchR亚基α6氨基酸序列与甜菜夜蛾的nAchR α6亲缘性较近；草地贪夜蛾nAchR亚基α7与棉铃虫的nAchR α7亲缘性较近(图2)。此外，各昆虫的nAchR亚基α6与α7之间具有较近的同源性(图2)。

2.3 乙基多杀菌素对草地贪夜蛾幼虫nAchR α6与α7亚基基因相对表达量的影响

草地贪夜蛾幼虫取食含有乙基多杀菌素(0.400 mg/L)的饲料后，其体内nAchR α6亚基基因表达量与对照相比显著上调(P<0.05)，为对照的2.22倍(图3: A)；而nAchR α7亚基基因表达量与对照相比表达量虽有上调，但未达到显著差异(图3: B)。

3 讨论

本研究根据草地贪夜蛾转录组数据，采用RT-PCR与RACE的方法，从草地贪夜蛾中经过筛选并克隆出了2个nAchR α6和α7亚基基因全长序列。结构域推断具有典型的nAchRs α亚基家族的基因特征(图1)。根据同源性比较发现草地贪夜蛾nAchR亚基α6同甜菜夜蛾nAchR亚基α6具有较高的同源性；草地贪夜蛾nAchR亚基α7同棉铃虫nAchR亚基α7具有较高的同源性。此外，根据秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans基因组序列，发现至少存在27个亚基，某些亚基在神经和肌肉细胞中都存在，而且存在于突触和非突触位点上(Jones and Sattelle, 2004)。这也可能预示着昆虫可能同线虫一样，具有丰富的nAchR亚基类型，这也为后续深入了解草地贪夜蛾烟碱性乙酰胆碱受体的类型奠定基础。随着昆虫nAchR亚基研究的日渐深入，同时也出现了众多问题。例如昆虫nAchR存在命名混乱的可能性。我们根据进化树分析得出，部分昆虫的nAchR α9, nAchR α10, nAchR β2与nAchR β3亚基被划分为同一类，表现出昆虫nAchRs的命名较为混乱。同样地，在家蚕nAchR亚基α8与黑腹果蝇nAchR亚基β2也表现出了较高的同源性。这可能跟昆虫nAchR亚基的命名方式是根据同属昆虫nAchR亚基而命名有关，如蚜虫的α1和α2亚基则是采用桃蚜Myzuspersicae的α1和α2的命名方式命名(Puineanetal., 2013)(图2)。

昆虫烟碱型乙酰胆碱受体是昆虫中枢神经系统中最重要的神经递质受体，因此基于该受体研发了一系列作用于烟碱型乙酰胆碱受体的杀虫剂，如沙蚕毒素类、多杀菌素类、烟碱类和新烟碱类等杀虫剂(Matsudaetal., 2001; Tomizawaetal., 2003)。乙基多杀菌素作为一种多杀菌素类杀虫剂，其与多杀菌素一样具有相同的作用方式。根据电生理学检测多发现，多杀菌素类杀虫剂通常与烟碱型乙酰胆碱受体相结合，使昆虫的nAchRs产生异常的生物学信号，诱使昆虫肌肉产生持续异常的生理行为，最终昆虫因自身能量的大量消耗而死亡(Salgado, 1998)。本研究初步分析了乙基多杀菌素对草地贪夜蛾的作用机理，结果表明在乙基多杀菌素胁迫下，草地贪夜蛾烟碱型乙酰胆碱受体亚基基因均有不同程度的表达，其中nAchR亚基α6基因在乙基多杀菌素胁迫下表达量显著性增加，而nAchR α7亚基基因的表达量无显著性变化(图3)，由此初步判断乙基多杀菌素作用于草地贪夜蛾的nAchR亚基α6。而谢丙堂等(2015)的研究表明乙基多杀菌素处理棉铃虫72 h后，nAchR α7亚基基因表达量被诱导，而且高剂量诱导作用明显，差异显著。这一结果与我们的研究结果正好相反，这说明乙基多杀菌素对不同昆虫的作用靶标位点具差异性。

随着现代分子生物学技术的发展，CRISPR/Cas9技术逐渐应用于农药毒理学研究。近年来研究发现CRISPR/Cas9敲除nAchR增加了甜菜夜蛾、小菜蛾Plutellaxylostella与棉铃虫对多杀菌素与乙基多杀菌素的敏感性(Wang Jetal., 2020; Wang XLetal., 2020; Zuoetal., 2020)。谢丙堂(2015)与Wang J等(2020)发现分别采用qPCR技术与CRISPR/Cas9技术验证乙基多杀菌素对棉铃虫的作用靶标时，前者发现乙基多杀菌素作用于棉铃虫nAchR α7，而后者发现乙基多杀菌素作用于棉铃虫nAchR α6，二者结果具有一定差异性。此差异性的出现可能与二者的实验技术相关。但是CRISPR/Cas9技术同其他定向基因组编辑技术一样，需要满足基因序列及结构已知的条件(张婷婷等, 2015)。因此，本实验获得的草地贪夜蛾nAchR亚基α6与α7的基因序列，可为后期采用CRISPR/Cas9技术进一步探究乙基多杀菌素对草地贪夜蛾的作用机理奠定了初步基础。