功能化聚乳酸-羟基乙酸共聚物基骨组织再生诱导膜的制备及其在大鼠颌骨缺损重建中的应用

刘一鸣 赵云，2 韩梅，2 章雨秋 米方林，2 王冰

1.川北医学院口腔医学系，南充 637000；2.川北医学院附属医院口腔科，南充 637000；3.川北医学院基础医学与法医学院化学教研室，南充 637000

牙周炎是由牙周致病菌及其毒性产物侵犯牙周组织导致的慢性炎症性疾病，导致牙周支持组织（如牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质）的破坏，最终导致牙齿脱落，严重影响患者口腔功能与美观[1]。牙周炎也是世界上最常见的由微生物引起的疾病之一，严重威胁着全球约7.43 亿成年人的口腔健康[2-4]。牙周组织再生是牙周治疗最理想的结果[5]，骨组织再生诱导术（guided bone regenera‐tion，GBR）是在龈下刮治术和根面平整术的基础上，利用GBR 膜作为屏障，阻挡上皮结缔组织进入骨缺损区并促进牙周膜细胞附着、增殖和分化，进而引导牙周支持组织再生[6-7]。理想的GBR 膜应具有良好的生物相容性，可降解性以及足够的机械强度以维持空间[8]。目前临床上常用的GBR 膜主要为来源于动物的胶原蛋白膜，其具有良好的骨组织诱导再生功能和生物降解性。谢苗苗等[9]采用海奥胶原膜行GBR 术修复骨缺损，结果显示骨生长效果为91.29%±2.37%（P＜0.05）。但胶原膜的不足之处在于其具有免疫原性，降解速度快，且来源较局限。

近年来，基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly-(lactic acid-co-glycolic acid)，PLGA）的静电纺丝支架材料在组织工程中得到了广泛应用[10]。静电纺丝纳米纤维膜的结构与细胞外基质（extracellu‐lar matrix，ECM）相似，具有可降解性、可设计性、高比表面积等优点[11-13]。通过负载不同的功能活性物质，调整纤维膜的结构和组成，赋予膜材料除基本功能以外的独特功能，如促进细胞黏附、增殖及定向分化[14-15]。小鼠颅顶成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）是从C57BL/6 小鼠颅盖骨细胞中建株的成骨细胞，具有碱性磷酸酶（alkaline phos‐phatase，ALP）活性和基质钙化等成骨细胞的生物学特性，常作为研究骨代谢的细胞模型[16]。本实验利用静电纺丝技术将环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列（cyclo-arginine-glycine-aspartic acid se‐quence，cRGD）、奥硝唑及纳米羟磷灰石（nanohydroxyapatite，n-HA）负载于诱导骨组织再生作用的功能层（guided bone regeneration layer，GBRL）及具有抑制纤维化作用的功能层（anti-fibro‐sis layer，AFL），并与具有支撑作用及隔离不同功能层作用的致密膜层（barrier layer，BL）进行复合，得到PLGA基多功能骨组织再生诱导纳米纤维复合膜（以下简称复合膜）（图1）。研究不同功能层对MC3T3-E1 及小鼠胚胎成纤维细胞（L929）细胞增殖的影响，研究负载奥硝唑的复合膜对牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gin‐givalis）的抑制作用；构建大鼠颌骨骨缺损模型，研究复合膜诱导骨组织再生的作用并与临床常用胶原口腔修复膜进行比较，为进一步研究其在牙周炎所致骨缺损修复中的应用打下基础。

1 材料和方法

1.1 材料

PLGA、聚己内酯-丙交酯（poly(ε-lactide-cocaprolactone)，PLCA）、cRGD、奥硝唑、对氧环己酮（polydioxanone，PDO）、n-HA（北京伊诺凯科技有限公司），聚(对氧环己酮-L-苯丙氨酸)（poly(p-dioxanone-co-L-phenylalanine)，PDPA） 为自行制备[17]，P.gingivalis、脑心浸液培养基（brain heart infusion medium，BHI）（宁波明舟生物科技有限公司），L929 细胞系和MC3T3-E1 细胞系及其特定培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司），细胞计数试剂盒（cell counting kit 8，CCK-8）（上海碧云天生物技术有限公司），钙盐染色液（Von Kossa 法）、Masson 三色染色试剂盒及苏木素伊红（hematoxylin eosin，HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），胶原口腔修复膜（烟台正海生物科技股份有限公司）。

1.2 复合膜的制备及其表征检测

1.2.1 流延膜的制备 将0.1 g PLGA、0.05 g PLCA溶于20 mL 二氯甲烷后倾入方形模具（15 cm×15 cm），置于通风橱内挥发溶剂，得到PLGA/PL‐CA流延膜，室温真空干燥24 h。

将0.1 g PLGA、0.05 g PLCA、0.8 g PDPA 溶于15 mL 六氟异丙醇，倾入方形模具（15 cm×15 cm），置于通风橱挥发溶剂，得到PDPA/PLGA/PLCA流延膜，室温真空干燥24 h。

1.2.2 GBRL 层的制备 将3 g PDO 置于圆底烧瓶，加入300 mg n-HA，抽出圆底烧瓶内空气，充入氮气后封瓶，40 ℃超声30 min使n-HA充分分散于熔融的PDO 中。后置于40 ℃油浴中加入3 mg 辛酸亚锡催化剂，抽空气充氮气重复置换瓶内气体3次后氮气氛围下封瓶，将油浴温度升至100 ℃，搅拌下反应24 h。打开瓶塞，加入20 mL六氟异丙醇后搅拌，使成功接枝聚对氧环己酮（poly(p-dioxa‐none)，PPDO）的n-HA 充分稳定分散于有机相，离心除去未接枝的n-HA，上清液加入无水乙醇50 mL沉降出n-HA-g-PPDO。

将所得n-HA-g-PPDO、0.3 g PLGA 和0.15 g PLCA 溶于9 mL 二氯甲烷和3 mL 二甲基碳酸酯（dimethyl carbonate，DMC）的混合溶液中制得有机相，将3 mg cRGD 和3 mg 奥硝唑溶于0.6 mL 生理盐水中制得水相，有机相加入100 μL 司盘80 乳化剂，35 000 r·min-1速率搅拌下缓慢滴入水相溶液，形成乳液。乳液置入注射器进行静电纺丝，电压8.5 kV，注射器泵流量3 mL·h-1，流延膜固定于接收装置接收纤维以形成复合膜，接收装置转速100 r·min-1，注射器扫描行程20 mm。

1.2.3 AFL 层的制备 将0.2 g PLGA、0.8 g PDPA溶于10 mL 六氟异丙醇置入注射器进行静电纺丝，电压8.5 kV，注射器泵流量3 mL·h-1，流延膜固定于接收装置接收纤维以形成复合膜，接收装置转速100 r·min-1，注射器扫描行程20 mm。

1.2.4 复合膜的形态表征 所得系列复合膜列于表1。采用扫描电子显微镜（scanning electron micro‐scope，SEM）观察复合膜GBRL 层的表面形貌；将复合膜修剪至5 mm×5 mm 大小浸泡于模拟体液中，1、2、3、4 周后真空干燥，SEM 观察复合膜降解后的形貌。

表1 系列复合膜的构成Tab 1 Composition of series of composite membranes

1.3 复合膜体外抑菌及细胞增殖实验

1.3.1 体外抑菌实验 称取3.3 g BHI培养基粉末溶于100 mL 超纯水中，搅拌混匀后加热至沸腾，高压蒸汽灭菌备用。P. gingivalis复苏后接种至BHI试管内，用厌氧培养袋密封，摇床140 r·min-1、37 ℃培养48 h。取4 份0.5 麦氏浓度的P.gingivalis菌液，每份100 μL，均匀涂布于血琼脂平板上，将直径为6 mm 的复合膜圆片M1、M2、M3 和M4分别置于血琼脂平板中央，在第3、21天后测量抑菌圈直径，重复3次取平均值。

1.3.2 细胞增殖实验 将系列复合膜平铺于96孔板中，MC3T3-E1 细胞以每孔1×104个的密度分别接种至M1、M2、M3、M4 的GBRL 面，对照组1 将MC3T3-E1 细胞直接接种在96 孔板上，每组设置6个复孔，在37 ℃、5%CO2下培养1、4、7 d[18]，避光条件下使用酶标仪在450 nm 处检测其光密度值（optical density，OD）。

将系列复合膜平铺于96 孔板中，L929 细胞以每孔8×103个的密度接种于M1、M2、M3、M4 的AFL 面，对照组2 将L929 细胞直接接种在96 孔板上，每组设置6 个复孔，在37 ℃、5%CO2下培养1、2、3 d[19]，避光条件下使用酶标仪在450 nm 处检测其OD值。

1.4 大鼠颌骨缺损模型的构建及体内抗菌与成骨修复实验

选取体重为（200±20）g 雄性SD 大鼠36 只，来源于川北医学院实验动物中心［编号：SCXK（川）2013-18］，操作在川北医学院实验动物中心进行［SYXK（川）2013-076］，实验过程对动物的处置符合相关动物伦理学要求。随机分成6 组，每组6 只，即M1 组、M2 组、M3 组、M4 组、对照（NC）组和胶原（COL）组。戊巴比妥钠麻醉后，将大鼠头部固定，下颌部剃毛并用碘伏消毒，沿大鼠下颌骨下缘作约1.5 cm 长切口，钝性分离各组织，暴露下颌角舌侧骨板。生理盐水冲洗冷却下，在距下颌骨下缘5 mm 与下颌角后侧5 mm交叉处使用牙科手机制备直径为3 mm 大小的洞穿骨缺损。对于M1 组、M2 组、M3 组和M4 组，将各复合膜贴附于骨缺损处的两侧，其AFL 面贴附于肌肉组织；NC 组不做任何干预；COL 组将胶原口腔修复膜贴附于骨损处双侧。所有分组缝合切口后再次消毒，术后青霉素（8×104U/只）肌肉注射1 次，预防切口感染。大鼠独立饲养仓喂养，自由饮食。在术后即刻、1周、2周、4周、6周和8周用小动物CT 观察大鼠颌骨缺损的修复情况，并用Mimics Medical 21.0软件进行三维重建、测量每只大鼠骨缺损的直径，并计算每只大鼠的骨体积重建率，骨体积重建率=［（首日骨损体积-各时间点骨损体积）/首日骨损体积］×100%。8周后对大鼠实施安乐死，分离下颌骨后4%多聚甲醛固定48 h。固定完成的标本制备切片，分别进行Von Kossa 染色、HE染色和Masson三色染色，使用光学显微镜观察并拍照。

1.5 统计学分析

所有数据均采用SPSS 22.0 软件进行分析，以均数±标准差表示。多组均数的比较用方差分析，P＜0.05记为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复合膜的表征

复合膜M1、M2、M3 和M4 的GBRL 表面的SEM 结果和降解不同时间后SEM 结果（图2）显示：各组复合膜的纤维直径均匀，纤维交叉排列形成类似ECM 的疏松多孔结构；虽然在4 周后纤维出现部分融合，但仍能维持基本的形态，其中M1 降解后的形态与降解初期无明显差异，这可能是因为M1 仅包含多孔GBRL 层，其AFL 层为PD‐PA/PLGA/PLCA 流延膜，导致其吸水率下降降解变慢所致。

2.2 体外抑菌实验结果

抑菌圈实验用来评估复合膜的体外抗菌效果，结果如图3 所示，未负载奥硝唑的M1 和M2 在第3 天以及第21 天未见明显抑菌圈，对P.gingiva‐lis无抑制作用；M3 在第3 天的抑菌直径为（34.2±3.3）mm，第21 天抑菌圈直径为（31.3±4.7）mm；M4 在第3 天的抑菌圈直径为（36.51±3.9）mm，第21 天为（33.57±4.6）mm；M3 和M4 的抑菌圈直径从第3 天到第21 天虽稍有下降，但在21 d 后仍能保持一定的抑菌效果。

2.3 细胞增殖实验结果

MC3T3-E1 细胞是常见的成骨细胞前体细胞，可以进一步分化为成骨细胞。如图4A 所示，L929细胞在复合膜AFL 面上均表现出先缓慢增加后降低的生长趋势，表明M1、M2、M3 和M4 均具有抑制成纤维细胞增长的效果，其中M1 的效果最差，是PDPA在流延层而非多孔AFL层，降解缓慢是L-苯丙氨酸释放不足所致，这与2.1 中观察到M1 降解速率低于其他各组的结果是一致的。如图4B 所示，MC3T3-E1 细胞在M1、M2、M3 和M4的GBRL 层上均表现出良好的增殖趋势，培养于M1的GBRL层上的细胞增殖速度最快。

2.4 Micro-CT结果

使用Mimics medical 21.0软件对大鼠下颌骨缺损区域进行观察，通过分析各组的骨缺损直径及骨体积重建率来比较各组的骨修复能力。从CT 水平面最大缺损直径影像比较，NC、COL、M1、M2、M3、M4 组在术后即刻达到最大缺损直径（图5A）；从第2 周开始，各组骨缺损直径均开始减小（图5B），且COL、M1、M2、M3、M4 组的重建速率均大于NC 组，表明胶原口腔修复膜和各复合膜均能促进骨缺损区域的修复重建，其中M3组重建速率最快，M2 组最慢。在第2 周时可见骨缺损区边缘稍不整齐（图5D），缺损区中心可见散在高密度影，4周后各复合膜组缺损区可见明显高密度影像，至第8 周时，M1、M3 与M4 组骨缺损已基本修复完成。由图5C 可知，在第2 周，M1、M2、M3 组的骨体积重建率均高于M4 组；在第4至8周，M1、M2、M3和M4组的骨体积重建率均高于NC 和COL 组；在第8 周，NC、COL、M1、M2、M3、M4 组的骨体积重建率均值分别为33.2%、63.4%、82.2%、70.9%、84.8%、75.1%，4种复合膜的诱导骨重建率均高于临床应用的胶原膜，其中M3组的骨体积重建率最高。

2.5 组织病理学结果

术后8 周，手术部位未脱钙Masson 三色染色如图6A 所示，COL 组和复合膜组均可见红蓝相间的新生骨组织，骨组织两侧可见较多成骨细胞分布，对照组骨缺损边缘较模糊，仅可见少量蓝色胶原纤维。Von kossa 染色结果如图6B 所示，钙盐沉积区域呈棕黑色，其中对照、COL和M4组见不连续棕黑色钙盐沉积，内有少量条状或蜂窝状未完全钙化的棕灰色区域；M1、M2 和M3 组可见大面积棕黑色钙盐沉积，钙化相对致密。HE 染色结果见图6C，对照组可见大量炎性细胞浸润，仅可见少量的成骨细胞；COL 组和复合膜组见毛细血管和新骨生成，M1 和M3 组的部分新骨已开始成熟并出现骨髓腔样结构。此外从图6D 可见，胶原组与复合膜组颌骨中被染成蓝红相间的新生骨组织与被染成褐红色的成熟骨组织有序分布，蓝染的胶原纤维较丰富（箭头所示），而对照组中蓝色胶原纤维较少，红染的结缔组织侵入缺损骨组织。

3 讨论

本实验利用静电纺丝技术制备多功能PLGA基静电纺丝复合纤维膜，包含贴附结缔组织的AFL层、BL层和具有诱导骨组织再生作用的GBRL层。AFL 的主要功能成分为PDPA，其在水中降解可释放L-苯丙氨酸，抑制成纤维细胞生长[20]。BL 具有一定的强度，在骨修复过程中能够支撑空间，阻止成纤维细胞等透过屏障膜到达硬组织层，并隔离AFL 降解过程中释放的L-苯丙氨酸，以免对成骨细胞产生影响，而GBRL 层则包含了有利于成骨细胞贴附的cRGD，诱导成骨细胞增殖及矿化的n-HA，以及抑菌抗生素。如图2所示，GBRL的表面在SEM 下纤维直径均匀，纤维交叉排列形成类似ECM 的疏松多孔结构，能够提供更多的结合位点，促进成骨细胞的黏附和迁移，并且随着GBRL的降解，能够实现对抗生素的缓释[21]。cRGD 为细胞跨膜蛋白整合素的结合位点，可通过整合素介导细胞黏附并转导生物信号，具有促进成骨相关细胞黏附和分化的能力[22]；羟磷灰石是人体牙齿和骨骼的主要无机成分，有一定的骨传导能力，能促进缺损骨组织的修复[23-24]；奥硝唑是一种硝基咪唑类抗生素，对各种厌氧菌有较好的抑制作用。

4 种复合膜在模拟体液中浸泡四周仍能维持基本形态，其中M1降解后形态与降解初期无明显差异，其AFL 层为PDPA/PLGA/PLCA 流延膜，而M2、M3 和M4 的AFL 层为多孔PDPA/PLGA 静电纺丝膜，M1 比M2、M3、M4 的AFL 层的结构更加致密，导致其吸水率下降降解变慢。Micro-CT影像和组织病理结果也显示其应用于大鼠体内后也可在较长时间内维持骨修复所需的空间，减少周围软组织的压迫并阻止结缔组织的侵入。随着降解时间的延长，M3 和M4 膜的形态发生变化较大，纤维出现融合，这可能是因为其所含的PLCA的玻璃化转变温度低，在水分子长时间的溶胀及塑化作用下分子链发生运动融合所致，但仍可以维持基本形态[25]。图3 中，M3、M4 的抑菌圈较大，这是因为其GBRL 中负载有奥硝唑，其通过材料的降解实现对奥硝唑的缓释。奥硝唑的缓释能够维持局部环境较高的有效药物浓度，抑制牙周炎主要致病菌P. gingivalis的生长，并且在21 d后仍有较强的抑菌效果，其意义在于避免全身大剂量使用抗生素造成细菌耐药性和不良反应。

细胞增殖实验结果（图4），接种于M1、M2、M3 和M4 的MC3T3-E1 表现出良好的细胞增殖趋势，其原因可能是静电纺丝纤维具有与ECM 相似的结构，且比表面积高、孔隙率高，有利于细胞黏 附、增 殖[26-27]；并 且M1、M2、M3 和M4 的GBRL 均负载cRGD，可通过整合素介导细胞黏附和生物信号转导，可促进细胞黏附增殖[28-29]。在第4 天和第7 天，M1 的MC3T3-E1 细胞OD 值均高于M2、M3、M4（P＜0.05），这可能是因为M1 相较于M2、M3、M4，在4 周之后仍能维持其疏松多孔的结构，具有更大的比表面积，有利于细胞的黏附；且M3、M4 中含有奥硝唑，其细胞毒性对MC3T3-E1 细胞的增殖有一定的影响。L929 细胞增殖实验结果表明，M1、M2、M3 和M4 均能抑制成纤维细胞增殖，其原因为AFL 层含有PDPA，PDPA 降解释放L-苯丙氨酸，抑制成纤维细胞增殖。其中M1 对成纤维细胞增殖能力抑制作用最弱，其原因为M1的AFL层为流延膜，降解速度较慢，其PDPA中的L-苯丙氨酸释放较慢，对成纤维细胞增殖抑制程度较低。

本实验应用大鼠下颌骨骨缺损模型，验证复合膜在体内的骨修复作用，应用影像学定量分析M1、M2、M3、M4、COL 组和对照组在术后即刻、第2 周、第4 周、第6 周和第8 周的新骨形成情况。如图5B 所示，在第8 周，M1、M2、M3、M4 及COL 组的最大缺损直径均小于NC 组，且从图5C 中同样可以看出M1、M2、M3、M4 组的骨体积重建率均高于COL 组和NC 组，这是因为具有梯度结构的复合膜既能依靠AFL 层的降解释放L-苯丙氨酸抑制结缔组织异常增生，GBRL层负载的cRGD 及n-HA 又能促进成骨细胞的黏附增殖。在不同复合膜中，又以M3修复效果最佳，这是因为相较于M1 来说，M3 的GBRL 层中额外负载了奥硝唑，降低了与植入物相关感染的可能性[30]，减少其对骨修复的影响，而M1 与M3 相比，其AFL 层降解速度较慢，对成纤维细胞增殖抑制作用差（图4B），这一点与图6D 的结果相一致；而M2 中同样不含有奥硝唑，图6A 中也可以看到其有大量的炎细胞浸润，这在一定程度上延缓了骨修复的进展；而M4 与M3 相比，其GBRL 中缺少n-HA，羟磷灰石的骨引导作用能够加速骨缺损组织的修复。组织切片染色也与影像学分析一致：M1、M3 和M4 组条带状新生骨组织内可见大量蓝色胶原纤维，骨组织两侧可见较多成骨细胞成片分布，表明其成骨细胞生长活跃；M1、M2、M3、M4 组较NC 组与COL 组均未见软组织侵入骨组织，表明复合膜起到了良好的屏障作用，有效地阻挡了成纤维细胞的干扰。综上，M1、M2、M3和M4 均有良好的促进骨组织再生能力，其中M3的骨修复能力最为突出。

综上所述，本实验采用乳液静电纺丝技术成功制备负载cRGD、奥硝唑和n-HA 的PLGA 基多层复合膜。该复合膜纤维直径均匀，具有疏松多孔的三维结构，生物相容性良好，体外抑菌实验表明其对P. gingivalis具有一定的抑制作用。大鼠颌骨骨缺损模型结果表明，其体内抗菌及骨修复能力良好，极有潜力应用于诱导牙周疾病所致牙周骨缺损的修复。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。