灵芝酸生物合成调控的研究进展

冷豆豆,尚丽,王洁,闫鹏,武忠伟,张广

（河南科技学院生命科技学院,河南 新乡 453003）

灵芝（Ganoderma lucidum）是我国传统的药食同源类大型真菌[1],具有延年益寿的功效[2].灵芝富含多糖、三萜类、核苷类和甾醇类等生理活性物质,研究发现其具有抗肿瘤[3]、抗衰老[4]、抗HIV以及免疫调节[5]等药理作用.灵芝三萜酸,简称灵芝酸（Ganoderic acids，GAs）,属于三萜类化合物,是灵芝药用功效的核心成分.研究表明,灵芝酸在肿瘤治疗[3]、抗氧化、抑制胆固醇合成、抑制血管紧张素转换酶活性、抑制组胺释放[4]、抗HIV等方面具有重要的作用[5].灵芝酸重要的生理功能使灵芝成为药物开发的潜在资源之一.提取灵芝子实体和孢子中的灵芝酸是获得灵芝酸的主要方式,但人工种植的灵芝,不仅生产力低下,而且产品质量不均一.采用发酵灵芝菌的方法提取灵芝酸具有省时、省力、节能和环保等优点[6].然而,灵芝菌发酵中灵芝酸含量低的现状限制了灵芝在临床上的应用和发展.解析灵芝酸生物合成途径及其调控机制对于提高灵芝酸含量具有重要意义.本文综合分析了灵芝酸的生物合成途径,从影响灵芝酸生物合成的基因、信号途径、环境因素和发酵条件等方面总结了灵芝酸生物合成及其代谢调控的研究状况,以期为创制高产灵芝酸菌株及其配套的发酵调控方式提供参考.

1 灵芝酸的生物合成途径

在萜类化合物的生物合成途径中,主要包括甲羟戊酸途径（MVA）[7]和丙酮酸/磷酸甘油醛途径[8].现有研究表明,灵芝酸是以乙酰辅酶A为前体物质再经过MVA途径进行合成[5].MVA途径主要有3个关键步骤,最终合成各种结构的灵芝酸：一是活性异戊二烯单位的合成;二是上游过程中环碳系统的生物合成;三是环上的官能化反应.通过对谭怡等[1]、陈慧等[2]和李丽等[9]总结的灵芝酸生物合成的途径进行汇总分析,推测得到较详细的灵芝酸生物合成MVA途径,如图1所示.

图1 灵芝酸生物合成途径Fig.1 The biosynthetic pathway of ganoderic acids

由图1可看出,在灵芝酸合成的MVA途径中,从乙酰辅酶A到2,3-氧化鲨烯这一过程基本清楚,涉及重要的催化酶基因已被鉴定.然而,在羊毛甾醇之后,羊毛甾醇经过哪些反应最终合成各种灵芝酸的途径尚不清楚,有待进一步研究.

2 调控灵芝酸生物合成的基因

2.1 调控灵芝酸合成的催化酶基因

在MVA合成途径（图1）中,灵芝酸合成有2个重要分支,一个分支是法尼基焦磷酸到牻牛儿基焦磷酸,另一个分支是法尼基焦磷酸到羊毛甾醇.这两个分支已克隆和报道的关键基因有FPS[10]、MVD[11]、AACT[12]、LS[13]、HMGR[14]、HMGS[15]、IDI[16]、SQS[17]和OSC基因[18],这些基因直接调控灵芝酸的合成,是灵芝酸合成积累的关键.在灵芝中过表达FPS[10]、MVD[11]、AACT[12]、HMGR[14]和HMGS[15]基因,灵芝酸含量与对照组相比可分别提高2.0、1.0、0.8、2.0、0.2倍.过表达GlLS基因引起LS合成量提高2.3倍,灵芝酸O、Mk、T、S、MI和Me含量相比原始菌株可分别提高6.1、2.2、3.2、4.8、2.0、1.9倍[19].细胞色素CYP450[20]被报道主要参与三萜类化合物的碳骨架修饰反应,Syed等[21]和Wang等[8]经过基因组测序分析,筛选得到219个CYP450基因,并根据这些基因在灵芝生长中的转录水平预测有78个CYP450基因与灵芝三萜合成呈正相关,将直接调控灵芝酸的生物合成.羊毛甾醇氧化酶CYP5150L8可催化羊毛甾醇形成灵芝酸HLDOA,在酿酒酵母中异源表达CYP5150L8,可提高HLDOA含量至14.5 mg/L[8].过表达灵芝酸生物合成途径中的关键催化酶基因可有效提高灵芝酸含量.

2.2 调控灵芝酸合成的其他基因

除灵芝酸生物合成途径中的催化酶基因直接调控灵芝酸的生物合成之外,许多其他基因也被报道通过灵芝酸生物合成途径中的关键基因或信号途径间接影响灵芝酸的生物合成.本文对已报道的间接影响灵芝酸生物合成的基因进行总结,具体如表1所示.

表1 影响灵芝酸生物合成的基因Tab.1 Genes affecting biosynthesis of ganoderma acids

由表1可知,NOXA、NOXB和NOXR可通过调控ROS信号和Ca2+信号影响灵芝酸合成;沉默AOX、GCN4、GlSnf1、ODC、GlSlt2、GlSwi6和Skn7,引起ROS含量变化与灵芝酸含量变化一致,表明这些基因通过ROS信号调控灵芝酸合成;沉默GlTert和GPx,虽引起ROS增加,但灵芝酸含量降低,进一步研究表明二者通过Ca2+信号调控灵芝酸合成;沉默Cch和PLC,引起Ca2+含量变化与灵芝酸含量变化一致,表明二者通过Ca2+信号调控灵芝酸合成;共沉默lag2/lag3、GlBmh1/GlBmh2、GlSpds1/2或沉默lag1、D9desA、D9desB、PLD、PacC、MADS1、CaM、AreA、LaeA、CBS、NR、Acon和GS引起灵芝酸含量升高或降低,表明这些基因参与调控灵芝酸合成,但其具体调控机制有待进一步研究.

3 调控灵芝酸生物合成的信号途径

3.1 Ca2+信号

在植物和真菌细胞中,普遍认为Ca2+信号是重要的诱导子和胞内信使,可诱导次级代谢产物的积累.细胞内Ca2+可与细胞中的钙调蛋白基因结合生成Ca2+/钙调蛋白复合物,该复合物进一步与钙调磷脂酶的催化亚基（Cna）互作从而激活转录因子锌指蛋白基因[47].研究表明,钙调磷酸酶信号通路是钙离子信号通路之一,Ca2+可能通过钙调神经磷酸酶信号通路参与调控灵芝酸的生物合成[42].Xu等[48]发现添加外源Ca2+,有利于提高灵芝酸含量.Li等[49]发现外源添加Ca2+可促进灵芝酸合成基因hmgr、sqs和Is及钙感应蛋白基因cam、cna和crzl的转录,表明Ca2+可通过激活Ca2+信号通路影响灵芝酸积累.此外,表1中Cch、Gpx也可通过Ca2+信号途径调控灵芝酸的生物合成.

3.2 ROS信号

活性氧（ROS）是重要的胞内信使,其在灵芝酸的合成中发挥着重要的调控作用.ROS被报道参与调控灵芝的生长发育、胞内Ca2+含量和次级代谢产物的合成等多种生理过程.Zhang等[28]和Wang等[29]发现细胞内的ROS减少,GA含量减少;Li等[31]和Gao等[50]也发现Ca2+的激活又将影响着ROS介导的GA合成,表明ROS与Ca2+在GA合成途径中可能存在交互作用.此外,表1中NOXA、NOXB、NOXR、GCN4和AOX等也可通过ROS信号影响灵芝酸的生物合成,这些研究结果均表明,ROS信号途径参与了灵芝酸的生物合成.

3.3 NO信号

NO在生物体中会影响细胞信号通路和调节靶细胞的基因表达.在灵芝中,Gu等[51]研究表明,添加NO供体（硝普纳）可通过上调灵芝酸生物合成途径中的关键基因的表达而提高灵芝酸的积累;Liu等[45]发现NO可降低热胁迫诱导的灵芝酸积累,进一步研究发现NO会减少细胞内ROS的含量,进而减少热胁迫诱导的灵芝酸的合成.这些研究均表明,NO信号参与调控灵芝酸的生物合成,但其调控机理还有待进一步研究.

3.4 细胞壁完整性信号途径

细胞壁完整性信号途径（CWI）被发现参与调控灵芝酸的生物合成.在酵母菌中,外界信号由细胞表面感受器Wsc1、Wsc2、Wsc3、Mid2[51]和Mtl1感应,之后通过Rho1将信号传递至丝裂原激活蛋白激酶MPK1和Mlp1,进而调控细胞壁的合成,Swi4/6、Skn7也参与调控CWI途径[52].在灵芝中,沉默丝裂原激活蛋白激酶（GlSlt2）基因[27]导致胞内ROS含量降低、灵芝酸含量降低;沉默Mapk4下游的Swi6基因也引起灵芝酸含量降低[28];沉默Skn7引起胞内ROS含量和灵芝酸含量的升高[29].这些研究表明细胞壁信号途径参与调控灵芝酸的生物合成.

4 调控灵芝酸生物合成的激素

茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、乙烯和cAMP都是重要的植物激素,可调控植物生长发育及其次级代谢产物的合成.这些植物激素均被报道参与调控灵芝酸的生物合成.辛燕花等[53]发现,在灵芝发酵液中添加MeJA（100 μmol/L）,含灵芝酸量达到50 mg/g,比对照提高2.2倍,与Ren等[54]的结果一致;进一步研究发现MeJA通过NOX产生的ROS信号来参与调控灵芝酸生物合成[55].叶丽云等[56]研究表明,在灵芝发酵液中添加SA（150 μmol/L）,含灵芝酸量变为46 mg/g,比对照提高0.37倍,与Cao等[7]和王丹丹等[57]的结果一致;Liu等[58]进一步研究发现SA通过抑制线粒体复合体Ⅲ的活性,促进ROS的生成,进而提高灵芝酸含量.Zhang等[59]发现,在灵芝发酵液中添加乙烯利（15.9 mmol/L）,含灵芝酸量达到33 mg/g,比对照提高0.9倍,表明乙烯可调控灵芝酸合成,但其调控机制有待解析.You等[60]研究发现,在灵芝发酵液中添加咖啡因（80 mmol/L）和NaF（20 mmol/L）,含灵芝酸量可提高3.3倍和2.3倍,同时灵芝胞内cAMP水平显著提高,暗示cAMP参与调控灵芝酸的生物合成,但其调控机制仍不清晰.

5 环境因素与发酵方式对灵芝菌发酵过程中灵芝酸积累的影响

5.1 环境因素

温度对灵芝生长发育和灵芝酸的生物合成有重要影响.Zhang等[32]研究发现热胁迫可调控灵芝酸的生物合成;Feng等[61]与刘月芹等[62-63]的研究表明不同温度对灵芝酸的生物合成影响较大;进一步研究发现,温度会影响灵芝的细胞膜流动性[36]、磷脂酸含量[37]、NO信号[45]、ROS信号、热激蛋白（HSP）表达和Ca2+信号[32]等,进而调控灵芝酸的生物合成.

培养基中pH值的改变可参与调控灵芝酸的生物合成.杨焱等[64]、赵艳等[65]、Tang等[66]的研究均发现培养基的pH值影响灵芝酸的生物合成;Ren等[67]进一步研究表明,外源添加乙酸可改变乙酸同化相关基因的表达,增加羊毛甾醇和鲨烯的含量,进而诱导灵芝酸的合成;Wu等[38]发现,沉默pH值响应转录因子基因PacC,可损害灵芝对胞外pH值的响应,同时提高胞内灵芝酸含量.

溶解氧在灵芝菌液体发酵时起着关键的调控作用.研究表明,灵芝在菌丝生长时需要较高的溶解氧,而生长后期较低的溶解氧可促进灵芝酸的合成[68];Zhang等[69]和方庆华等[70]发现“氧限制”现象会有利于促进灵芝酸的生物合成;Fang等[71]和Xu等[72]发现在灵芝发酵培养过程中先通气振荡培养再静置培养可显著提高灵芝酸含量.这些结果均表明,溶解氧参与调控灵芝酸的生物合成,是灵芝三萜发酵的重要影响因素之一.

蓝光是影响真菌的主要光信号之一,可参与调控灵芝酸的生物合成.徐新然等[73]发现,在孢子弹射前期蓝光处理可显著提高灵芝酸含量,而孢子在弹射后期蓝光处理会降低灵芝酸含量;王立华[74]和梅锡玲[75]采用不同光质对灵芝进行处理,发现采用蓝光处理灵芝,灵芝酸含量高于其他光源处理;孙恬等[76]以不同的膜栽培灵芝,发现使用蓝膜栽培灵芝更有利于灵芝酸的合成.这些结果均表明,蓝光可以促进灵芝酸的合成.

5.2 发酵方式

发酵调控是提高灵芝酸含量的有效手段.灵芝液体发酵体系中的碳源、氮源及其比例会显著影响灵芝酸的生物合成[77];在灵芝液体发酵时,改变其发酵方式和补料方式可显著影响灵芝酸的生物合成.表2总结了不同发酵方式对灵芝酸生物合成的影响.

表2 发酵方式对灵芝酸生物合成的影响Tab.2 Effect of fermentation mode on the biosynthesis of ganoderic acids

由表2可知,钟建江课题组经研究提出两阶段培养（液体震荡培养结合静止培养）是一种非常有效的提高灵芝酸含量的发酵方式[71],且在灵芝液体发酵震荡阶段通过改变转速可进一步提高灵芝酸含量[78].关于补料方式对灵芝酸含量的影响,冯杰等[79]通过研究表明,相比其他补料方式,指数补料方式获得的灵芝酸含量最高,含灵芝酸量可高达45.8 mg/g.

5.3 外源诱导子

在灵芝液体发酵时,优化发酵条件和发酵方式是提高灵芝酸含量的经典方法,但在发酵体系中添加外源诱导物质也可有效提高灵芝酸含量.表3对影响灵芝酸生物合成的外源诱导子进行了总结.

表3 外源诱导子对灵芝酸生物合成的影响Tab.3 Effect of exogenous inducers on the biosynthesis of ganoderic acids

由表3可知,在灵芝发酵体系中,添加金属离子Mn2+和Na+可通过激活Ca2+信号通路调控灵芝酸的积累水平,添加Cu2+和稀土元素镨或镧也可提高灵芝酸含量;添加乙酸钠可通过改变发酵体系的pH值提高灵芝酸含量;添加中草药甘草或枸杞水提物可通过影响细胞壁通透性促进灵芝酸合成;添加真菌多糖激发子等其他物质可通过改变灵芝酸合成关键酶基因的转录提高灵芝酸含量,但其调控机制不清晰.液体发酵中添加诱导剂是提高灵芝酸含量的主要策略之一,结合发酵条件优化可有效提高液体发酵中灵芝酸的积累水平.

6 展望

作为大型药用真菌,灵芝中的灵芝酸具有重要的药用功效,解析灵芝酸生物合成途径及其生物合成的调控机制有助于提高灵芝酸含量.在灵芝酸生物合成的MVA途径中,从乙酰辅酶A到羊毛甾醇的上游过程中的关键酶基因（AACT、HMGS、HMGR、MVD、FPS、SQS和LS）已经被克隆并表征,这一过程基本清晰.但从羊毛甾醇到各种具体灵芝酸的下游合成途径还不清晰,这一过程中许多碳环骨架的修饰及其中关键酶的作用机制尚不清楚,值得重点关注和研究.

灵芝酸生物合成的调控机制较为复杂,众多因素参与调控灵芝酸的生物合成.目前发现AOX等12个基因可负调控灵芝酸的生物合成,NOXR等17个基因可正调控灵芝酸的生物合成;Ca2+信号途径、ROS信号途径、NO信号途径和CWI信号途径可参与部分基因调控灵芝酸生物合成的过程;MeJA、SA、乙烯和cAMP等植物激素可诱导灵芝酸的生物合成.基因互作、基因与信号途径及植物激素之间的互作对灵芝酸合成调控的深入研究将对解析灵芝酸合成调控机制起着关键的作用,需要进一步加强.此外,环境因素（温度、pH值、溶解氧和光照）和发酵方式等因素也显著影响灵芝酸的生物合成.完全解析灵芝酸的生物合成的下游途径、构建灵芝酸生物合成的全局性调控机制图、结合环境因素优化灵芝酸的发酵体系将是未来的重点研究方向,可为有效提高灵芝酸含量奠定基础.