应用磁共振波谱研究针刺合谷穴前额叶神经递质Glu与GABA相关性＊

赵彦萍，陈媛媛，方继良＊＊，洪 洋＊＊，王 珺，孙 黎，王 智

（1.中国中医科学院广安门医院 北京 100053；2.北京市平谷区中医院 北京 101200）

合谷穴在头面五官疾病治疗中疗效突出，《四总穴歌》中概括为“面口合谷收”，但其脑效应机制尚不完全明确。MEGA-PRESS（MEscher-GArwood point resolved spectroscopy，MEGA-PRESS）序列是唯一无创性检测活体组织器官代谢物浓度的技术[1]，为检测γ-氨 基 丁 酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、谷 氨 酸(glutamine，Glu)和谷氨酸谷氨酰胺复合物（Glutamate+Glutamine,Glx）提供了新方法。血氧水平依赖功能磁共振脑成像（blood oxygen level dependent functional MRI,BOLD-fMRI）能在活体状态下检测脑内血流变化，其信号强度存在正、零、负激活；正激活反映神经元兴奋，脑血流量增加；但零、负激活原理尚不完全明确，有“盗血”、神经抑制等假说。大脑皮层功能正常发挥作用依赖于皮层兴奋和抑制因素的动态平衡，该平衡与脑内主要抑制性神经递质GABA和兴奋性神经递质Glu活性密切相关[2]，已受到越来越多研究者关注。目前这方面的研究不多，最初研究者发现健康人在疼痛、视觉、直流电等非针刺刺激时不同脑区内Glu、Glx、GABA浓度改变[3-5]；随后研究者发现健康人在不同刺激时，相同脑区出现正、负不同激活状态，并且研究了不同激活状态时Glu、Glx、GABA浓度改变[6]；同时研究者发现健康人不同脑区Glu或Glx与GABA存在动态平衡，并尝试进一步量化动态平衡比例[7-10]；最后研究者发现一些精神或神经疾病患者与健康对照者相比的特定脑区内Glu、Glx与GABA平衡或浓度参考值失衡，提出可将其作为临床生物指标[11-12]。针灸作为中国特色的绿色疗法，具有双向调节作用，同时具有个体差异性。目前有关针刺脑内代谢物浓度改变的文献研究非常少，有关研究针刺不同Bold激活状态时脑内各种代谢物浓度改变的文献研究就更少，尤其是关于抑制性神经递质GABA和兴奋性神经递质Glu浓度改变的相关文献研究。我们之前的研究[13-14]表明，手针与纤毛针刺激合谷穴均能诱发以边缘叶-旁边缘叶-新皮层网络为主的大脑皮层广泛的负激活，同时诱发包括大部分双侧前额叶内侧皮层（medial prefrontal cortex，mPFC）及少部分前扣带回（anterior cingulate cortex，ACC）皮 层 的 感 兴 趣 区（Region of interest，ROI）内Bold的正、零及负激活，但手针针刺负激活范围更广、强度值更大，并初步探讨了脑功能Bold信号与兴奋性神经递质Glu的关系[15]；本课题通过研究手针针刺前与针刺时不同Bold激活状态下，ROI内兴奋性与抑制性神经递质浓度变化及相关性，初步探讨健康人针刺效应的脑机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本研究招募76例健康受试者，女53例，男23例，年龄20-30岁，平均（24.5±1.4）岁。纳入标准：①右利手；②男女不限；③无fMRI禁忌证，如患幽闭恐惧症者或妊娠期妇女等；④既往无神经、精神异常，无内科疾病及无脑部外伤史、手术史等。本课题通过中国中医科学院广安门医院伦理委员会审批（伦理编号：ECAF-055），检查前向所有受试者解释试验过程、目的、潜在不适和危险性及需要同时接受手针针刺及纤毛针两种刺激，受试者均自愿参加研究，并签署知情同意书。

1.2 仪器与方法

采用德国Siemens Magneton Skyra 3.0T超导MR仪，20通道头颈线圈，针刺组采用0.4 mm×25 mm一次性无磁不绣钢针（苏州医疗用品厂有限公司），对照组采用规格为5.88的Von Frey纤毛表皮刺激针（Patterson Company，USA）（简称纤毛针），通过刺激皮肤表面模拟针刺。嘱受检者仰卧闭眼，采集全脑解剖成像、针刺前采集BOLD-fMRI及MRS序列，随后安排1名具有5年以上工作经验的针灸科医生进入扫描室，消毒右手第二掌骨桡侧区域皮肤，进行手针或纤毛针操作，同时采集针刺时的BOLD-fMRI及MRS序列。

扫描参数：全脑解剖成像采用磁化准备快速梯度回 波（magnetization-prepared rapid gradient-echo，MPRAGE）序列，TR 15 ms，TE 6.9 ms，FOV 256 mm×256 mm，FA 15°，层数196，层厚1 mm；BOLD-fMRI采用多层平面回波成像（echo planar imaging，EPI）序列，

TR 750 ms，TE 30 ms，FA 90°，FOV 210 mm×210 mm，矩阵70×70，层数48，层厚3 mm，层距0，扫描时长6 min 46 s，轴位定位线平行前、后联合连线（AC-PC线），扫描范围包括小脑和脑干；MRS采用MEGAPRESS序列，TR 2000 ms，TE 68 ms，采集次数128，脉冲频率1.9 ppm，中心频率4.7 ppm，时间8 min 40 s，全宽半高＜30，于mPFC及ACC勾画35 mm×30 mm×25 mm大小ROI，垂直于AC-PC线的平行线，长方体后壁中点位于胼胝体尖端（图1），避开额骨、额窦及双侧侧脑室前角，并在ROI的前、上、下部设置饱和带，以减少伪影。所有受式者均接受手针和纤毛针两种针刺方式，两种刺激方式通过随机信封分配，时间间隔1周。针灸科医师根据扫描触发指令完成3次手针平补平泻捻转或Von Frey纤毛针表面垂直刺激，频率60次/min，持续30 s，刺激间隔2 min（图2），针刺结束询问并记录志愿者每个受试者酸麻胀痛等针感及程度。

图1 MRS矢、冠、轴定位图（红色为ROI）

图2 针刺模式示意图

1.3 数据分析

1.3.1 MRS

将MRS原始数据转化为*.rda格式，应用LC Model（Linear Combination Model in vitro spectra，LC Model）软件进行后处理，获得Glx及GABA浓度定量值及曲线（图3）。采用Matlab 8.0及SPM 12软件将健康受试者全脑解剖成像进行分割、配准，标准化，得到脑灰质（gray matter，GM）、白质（white matter，WM）及脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）体积，计算GM体积的比例，分析得到的矫正Glu、Glx、GABA含量，以Glu+、Glx+、GABA+表示。

图3 MRS曲线

1.3.2 BOLD-fMRI

将fMRI原始数据转化为*.nii格式，采用SPM 12软件行预处理及个体分析，参考文献[16]计算ROI内灰质内正、负BOLD信号强度值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 23.0统计分析软件，满足正态分布且方差齐的计量资料以±s表示，采用独立样本t检验比较组间MRS定量值差异；采用配对t检验比较组内静息与任务时MRS定量值差异。采用Pearson相关性检验分析静息状态与任务时Glu+、Glx+、GABA+的浓度及Glu+、Glx+与GABA+浓度的相关性。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 研究结果

2.1 ROI内Glu+、Glx+、GABA+浓度及相关性分析

3名受试者Glx标准差＞15%，2名受试者GABA标准差＞15%，予以排除，共纳入71名受试者进行Glu+、Glx+、GABA+浓度及相关性分析；手针组正激活11名、零激活13名，负激活47名，平均BOLD信号强度为-1.506±2.315；纤毛组零激活16名、零激活14名，负激活41名，平均BOLD信号强度为-0.942±2.377。

2.1.1 两组间Glu+、Glx+、GABA+浓度差异

刺激前、刺激时整组、各亚组手针组与纤毛针组Glu+、Glx+、GABA+浓度差异无统计学意义（P均＞0.05）（表1）。

表1 两组间ROI内Glu+、Glx+及GABA+浓度差异

2.1.2 两组内Glu+、Glx+、GABA+浓度差异及相关性

手针组、纤毛组内整组与各亚组针刺前与针刺时Glu+、Glx+、GABA+浓度的差异无统计学意义（P均＞0.05）。手针整组针刺前与针刺时Glu+、Glx+、GABA+浓度，零、负激活亚组针刺前与针刺时Glu+、Glx+及零激活亚组针刺前与针刺时GABA+均呈正相关（P均＜0.05）；纤毛组整组针刺前与针刺时的Glu+、Glx+浓度及零激活亚组针刺前与针刺时Glx+均呈正相关（P均＜0.05）（表2）。

2.1.3 两组内Glu+、Glx+浓度与GABA+浓度相关性

针刺前手针整组、零、负激活亚组，纤毛针整组、正、负激活亚组Glu+、Glx+与GABA+以及零激活Glu+与GABA+均呈正相关（P均＜0.05）；针刺时手针整组Glu+、Glx+与GABA+浓度，负激活亚组Glu+与GABA+浓度以及零激活亚组Glx+与GABA+浓度均呈正相关（P均＜0.05）（表3）。

表3 ROI针刺前与针刺时Glu+、Glx+及GABA+浓度相关性

3 讨论

大脑皮层各种功能正常发挥作用依赖于皮层中兴奋性和抑制性因素的动态平衡，这一平衡与兴奋性递质Glu和抑制性递质GABA的活性密切相关[14,17-18]，Glu与GABA相互作用从而调节神经元放电频率，影响BOLD-fMRI信号。BOLD-fMRI主要检测脑内血氧饱和度，其BOLD信号正、零、负激活及程度主要取决于供氧量与耗氧量的相对关系。刺激不仅能引起血流量增加供氧量增加，同时也引起神经兴奋升高或抑制性降低耗氧量增加；目前，BOLD信号与神经递质浓度关系尚无定论。本课题通过研究针刺前、针刺时ROI区内BOLD正、零、负激活Glu+、Glx+及GABA+浓度的关系，初步探讨健康人BOLD信号与神经递质关系的针刺脑机制。

Gutzeit、Cleve等[3-4]发现疼痛感知时岛叶、前扣带回和枕叶皮层的Glx升高，同时前扣带回和枕叶皮层GABA下降[4]；Kupers[5]发现热疼痛刺激时，前扣带回喙部（rACC）的GABA升高，Glu和Glx无变化。Stagg等[19]通过经颅直流电刺激时，阴极刺激后中央前回Glu显著降低，阳极刺激后Glu无显著变化，而GABA浓度明显下降。首先神经递质传递和代谢迅速，较长时间的刺激可能产生适应性，并且Glu受内环境调控，存在预防兴奋性毒性环路机制[18,20]；其次，重复抑制效应，通常能使神经元产生适应性而减少活动[17]，上述因素可能致Glu、Glx及GABA变化微弱；本研究Block刺激模式时间长、重复相同刺激，可能导致Glu+、Glx+、GABA+浓度刺激时与刺激前相差不明显，不能体现Glu、Glx、GABA短时、快速变化。

目前任务引起Glu、Glx、GABA浓度变化及相关性研究尚无定论。Cleve等[21]研究发现疼痛刺激时前扣带回皮质、枕叶皮层Glx/tCr升高，同时GABA+/tCr降低；Ip[22]等研究发现随着视觉刺激增加，Glx浓度明显增加，而GABA浓度维持不变；Boillat等[23]研究发现不同视觉刺激正激活区Glu增加，而负激活区GABA、Glu浓度降低；Stagg等[19]研究发现颅内直流电刺激后，健康受试者感觉运动皮层的Glx及GABA浓度均减少，并呈显著正相关；Martı′nez-Maestro等[6]研究不同视觉刺激，发现正激活时Glu浓度增加，负激活Glu浓度减低；本研究发现针刺Bold正激活时Glu+、Glx+、GABA+浓度均增加，但无统计学差异（P均＞0.05），Glu+、Glx+增加较多，而GABA增加较少；针刺Bold负激活时GABA+浓度减低，Glu+、Glx+略增加、但无统计学差异（P均＞0.05）。综上所述，目前Glu、Glx、GABA浓度方面研究方法众多、结果也不尽相同；以BOLD激活状态为基础研究脑内代谢物的方式被越来越多研究者认可，如Boillat等[23]研究发现正激活区Glu浓度升高，负激活区Glu浓度降低；IP等[22]研究发现Glu浓度与Bold信号强度呈线性关系，我们研究也发现不同激活状态时Glu、Glx、GABA浓度变化不同，故推测不同激活状态神经递质变化存在差异，这仍需进一步研究证实。

研究发现静息时健康人Glu、Glx与GABA浓度多呈正相关，与神经系统中兴奋性和抑制性递质（excitaory and inhibitory,E/I）维持平衡状态的假说一致。Steel等[7]研究发现静息时多个脑区Glx和GABA浓度呈明显相关性；Wiebking等[24]发现静息时健康志愿者岛叶和前额叶内侧皮层的Glu和GABA浓度呈正相关。Stagg等[25]研究发现静息时运动皮层Glx与GABA浓度呈正相关；而Barron，Gu及Bezalel等量化GABA与Glu[8-9]和GABA与Glx[10]比值，将其作为测量特定脑区E/I平衡参考值，为疾病诊断或治疗提供帮助，如Chiu等[12]研究发现精神分裂患者前扣带回GABA与Glx平衡参考值变化，具有诊断精神分裂症的潜力。本研究发现手针与纤毛针针刺ROI的Glu+、Glx+与GABA+浓度多呈正相关（P均＜0.05），验证了健康人前额叶内侧皮层兴奋性和抑制性神经递质维持平衡状态的假说，为进一步研究探讨与前额叶内侧皮层相关的精神或神经疾病奠定一定基础，同时需扩大样本量测出健康人相应脑区平衡比值的参考范围，与某些疾病进行比较，可能为该疾病的早期诊断提供帮助。

任务引起的Glu、Glx与GABA浓度相关性研究文献非常少，研究结果尚无定论，其机制分析少且存在分歧，有些研究者认为可能与刺激时的生理状态[26]或任务负荷程度[27]等相关，目前研究发现神经活动时脑皮质回路特定神经元接收大约相等数量的兴奋和抑制信息，这些信息动态、精准相互抵消，诱发感觉电位和维持神经活动[8,28]，是大脑精确定时以及防止过度兴奋的关键；本研究发现手针组针刺时各亚组Glu+和或Glx+与GABA+，并多呈正相关（P均＜0.05），而BOLD正、零激活时GABA+浓度增加，负激活时GABA+降低，验证了脑皮质回路理论，并推测针刺健康人Glu+、Glx+与GABA+浓度变化与BOLD激活状态有关，这可能取决于个体对刺激敏感度与刺激量；如某个固定刺激量，对一些个体表现为正激活，同时兴奋和抑制递质浓度均增加；对另一些个体表现为负激活，同时兴奋性递质浓度增加，抑制性递质浓度减少，但抑制性递质减少是因为兴奋性与抑制性递质相互抵消还是因为谷氨酸脱羧酶（GAD-67）活性降低所致，仍需进一步研究。

本研究的局限性：首先本研究以皮边缘叶-旁边缘叶-新皮层网络中负范围更广、强度值更大前额叶内侧皮层为感兴趣区，故正、零激活亚组数量较少，研究结果可能存在偏倚；其次缺乏对手针刺激量的定量标准，同时没有考虑到针刺的个体差异性以及穴位的双向调节作用；最后未涉与疾病状态下对比研究。

4 结论

本研究发现手针针刺健康人合谷穴前、后前额叶Glu和GABA存在相关性，可作为针刺脑机制研究的重要参考指标，有可能为相关疾病的早期诊断提供帮助。