基于p38MAPK/NF-κB信号通路探讨苏木提取物对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的机制研究＊

范增光，袁 野

（江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种以动脉血管壁白细胞浸润为特征表现的慢性炎性疾病，以脂质沉积，血管硬化，弹性下降，内膜斑块形成及管腔狭窄为主要病理变化，是心脑血管疾病发生发展的重要原因[1-3]。近年来，AS发病率呈逐年上升状态，根据WHO最新统计的数据可以看出，全球每年大约有1790万人死于AS相关的心脑血管疾病，占全球总死亡率的31%，已经成为严重威胁人们健康的慢性疾病之一，因此，深入研究AS的发病机制，并以此为靶点延缓，甚至逆转AS进程，是降低心脑血管疾病的关键[4-5]。越来越多的研究表明，炎症反应在AS的各个阶段均起到关键的作用[6-7]。并且关于炎症因子及C反应蛋白的研究已取得初步成效，研究表明，直接靶向炎症因子治疗AS成为目前的研究热点[8]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路广泛存在于细胞中，可调节多种生物过程，如细胞生长、趋化及增殖等，对多种心血管疾病进展均发挥着重要作用，而p38MAPK是MAPKs信号通路家族成员之一，与AS的形成具有密切的关系，p38MAPK在受到外界刺激后发生磷酸化而被激活，从而引发多种生物学反应，可促进VSMCs增殖信号传入细胞核，使其从中膜迁至内膜，并发生增殖，促使机体内发生炎症性瀑布反应，进而促进了AS的发生和发展[9-12]。核转录因子-κB（NF-κB）是p38MAPK的下游信号通路，NF-κB是炎症最重要的调节因子之一，其主要形式为p50和p65组成的二聚体，参与AS病理过程的各个阶段[13-15]。研究表明，当NFκB被激活后，NF-κB可以从IκBα释放，使得NF-κB由细胞质转移至细胞核，并在其中介导炎性因子及趋化因子如IL-6、TNF-α和ICAM-1的产生和分泌，进而诱发或促进AS的发生[16]。

本课题组前期研究证实了苏木是一种具有抗炎、免疫抑制、抗心脏移植排斥反应、保护血管、抗肿瘤、抗氧化等多方面的作用的药物[17]。近年来，关于苏木的实验及现代药理研究大多围绕在抗炎、免疫抑制等方面，其中苏木抗动脉粥样硬化的作用虽然已得到证实，但是具体的机制尚未完全阐述清楚，故深入研究其抗动脉粥样硬化的作用机制显得尤为重要。因此，本研究拟从p38MAPK/NF-κB信号通路入手，探讨苏木提取物是否通过该途径调节AS模型小鼠的炎症因子、粘附分子及血脂水平，为进一步探讨苏木提取物治疗AS的具体机制提供可靠的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

8周龄雄性ApoE-/-小鼠40只和相同基因背景的8周龄雄性C57BL/6J小鼠10只，体质量约18-21 g，许可证号SCXK（京）2016-0006，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养于清洁级动物实验室，调节温度（20-25）℃，湿度（55±15）%，风速（0.1-0.2）m·s-1，12 h循环照明。

1.2 实验药物

苏木提取物制备：取苏木生药，产地为云南，购于黑龙江省药材公司，由黑龙江中医药大学药学院提取和制备。具体方法：经生药鉴定制成40目苏木粗粉并浸泡浓度为75%乙醇溶液中4 h，经重复回流2次，去渣，加热至85℃，水浴蒸干制成干粉，将提取的干粉加入双蒸水中充分混匀得到混悬液，然后使用乙酸乙酯进行萃取，即得到苏木提取物。

1.3 实验试剂与仪器

苏木伊红染液（碧云天生物）、4%多聚甲醛（武汉塞维尔公司）、ELISA试剂盒（碧云天生物）、p38MAPK及NF-κB抗体（德国CST公司）。显微镜（广州明美光电技术有限公司）、4℃冰箱（青岛海尔股份有限公司）、-80℃超低温冰箱（中科美菱）、石蜡切片机（德国Leica公司）、石蜡包埋机（德国Leica公司）、液氮罐（中国四川乐山东亚公司）、离心机（常州峥嵘仪器有限公司）、移液枪（德国Eppendorf公司）、全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技）等。

1.4 动物分组

所有小鼠适应性饲养2周后，将10只C57BL/6J小鼠设为空白组（Control）；40只ApoE-/-小鼠随机分为，模型组（Model）、苏木提取物低剂量组（Low-dose SEAE），苏木提取物中剂量组（Medium-dose SEAE），苏木提取物高剂量组（High-dose SEAE），每组10只。

1.5 模型制备

本实验采用高脂饮食喂养复制动脉粥样硬化模型：小鼠适应性喂养2周后，C57BL/6J小鼠继续给予普通饲料喂养；ApoE-/-小鼠给予高脂饲料（含15%可可脂、2.5%胆固醇）喂养8周建立动脉粥样硬化模型。

1.6 动物给药

配制成为5‰的羧甲基纤维素钠溶液（CMCNa）。根据课题组前期实验结果及人小鼠换算公式给药，小鼠的给药剂量=人的剂量（mg·kg-1）×人的体重（kg）×换算系数（0.0026）/所求动物的体重（kg）。于实验的第9周对各组小鼠进行灌胃，时间为4周。具体方法如下：①空白组：等体积的5‰ CMC-Na（0.1 mL/10 g）灌胃；②模型组：等体积的5‰ CMC-Na（0.1 mL/10 g）灌胃；③苏木提取物低剂量组：苏木混悬剂（0.1 mL/10 g）灌胃，相当于生药量0.83 g/（kg·d）；④苏木提取物中剂量组：苏木混悬剂（0.1 mL/10 g）灌胃，相当于生药量1.66 g/（kg·d）；⑤苏木提取物高剂量组：苏木混悬剂（0.1 mL/10 g）灌胃，相当于生药量3.32 g/（kg·d）。

1.7 标本取材与指标检测

于实验的第12周末，小鼠禁食12 h，不禁水，10%水合氯醛（0.1 mL/10 g）腹腔注射麻醉，摘取眼球取血，3000 r·min-1，离心10 min，分离血清；剥离主动脉，并将周围的组织剔除干净，取主动脉根部，用4%多聚甲醛溶液固定，用石蜡包埋标本，切片备用。

1.8 HE染色观察主动脉窦病理形态

取固定好的主动脉根部，制备石蜡标本、切片，苏木素溶液中染色5 min，清水冲洗1 min，1%盐酸乙醇溶液分化10 s，清水冲洗3 min，用0.5%伊红染色2 min，清水冲洗1 min，依次放入不同浓度的乙醇溶液中脱水，再放入二甲苯中透明，中性树胶封片，光镜下观察各组小鼠主动脉窦部病理形态改变，并拍照。

1.9 ELISA检测血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1水平

按ELISA试剂盒说明书的步骤，检测IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1的含量。

1.10 全自动生化仪测定TC、TG、LDL-C、HDL-C水平

应用全自动生化仪测定TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.11 Western Blot法检测p38MAPK、NF-κB蛋白表达

取小鼠主动脉组织匀浆，进行总蛋白的提取。根据BCA蛋白质浓度测定试剂盒说明书测定样品蛋白浓度。取40µg蛋白，在SDS/PAGE中以分离胶电压按120 V、浓缩胶电压按50 V进行恒压电泳。100 V恒压转膜，并根据靶蛋白的分子量大小调整。转膜结束后，取下支架，将转好的膜放入封闭液中，室温下封闭1 h；弃去封闭液，加入已稀释的一抗缓冲液中，4℃过夜；回收已稀释好的一抗，室温下TBST漂洗3次，每次5 min；加入稀释好的二抗，室温下培养30 min，室温下TBST在摇床漂洗4次，每次5 min。在NC膜的蛋白面侧滴加超敏ECL显色液，暗室中操作；将胶片依次显影、定影后，用Image J软件计算各条带的密度值，以目的条带密度值与内参（GAPDH）密度值的比值，作为其相对表达量。

1.12 统计学分析

应用SPSS23.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，统计方法采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐者行LSD检验，方差不齐者行Dunnett’s T3检验。以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义，P＞0.05为差异无统计学意义。

2 结果

2.1 对病理形态的影响

空白组小鼠主动脉内膜各层结构及层次清晰，内膜光滑，血管内皮完整连续，未见明显的脂质沉积及斑块形成；中膜可见梭型排列整齐的血管平滑肌细胞；外膜为疏松的结缔组织；模型组小鼠主动脉内膜排列紊乱，内皮增厚；中膜可见排列不整齐的平滑肌细胞，局部可见炎症细胞浸润，并有脂质斑块形成，呈AS病理形态学改变；苏木提取物低剂量组、苏木提取物中剂量组、苏木提取物高剂量小鼠主动脉窦AS病理形态学改变均较模型组有一定的改善，表现为小鼠主动脉窦部血管壁三层结果基本完整，内皮细胞表面排列不规整，可见少量脱落的内皮细胞（图1）。

图1 各组小鼠主动脉窦HE染色结果（×200）

2.2 对小鼠血清IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1的影响

2.2.1 对IL-1β、TNF-α的的影响

如表1所示：与空白组比较，模型组小鼠血清IL-1β、TNF-α水平升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，苏木提取物低剂量组、苏木提取物中剂量组、苏木提取物高剂量组IL-1β、TNF-α水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（图2）。

表1 各组小鼠血清IL-1β、TNF-α水平比较（±s，pg·mL-1，n=10）

表1 各组小鼠血清IL-1β、TNF-α水平比较（±s，pg·mL-1，n=10）

注：**P＜0.01 vs Control group；#P＜0.05 vs Model group；##P＜0.01 vs Model group。

Group Control Model Low-dose SEAE Medium-dose SEAE High-dose SEAE IL-1β 43.72±1.95 80.59±1.88**77.73±2.60#63.43±3.09##60.13±2.48##TNF-α 44.29±1.84 81.72±2.64**79.52±1.43#66.88±2.01##64.07±1.74##

图2 各组小鼠血清IL-1β、TNF-α水平比较

2.2.2 对ICAM-1、VCAM-1的影响

如表2所示：与空白组比较，模型组小鼠血清ICAM-1、VCAM-1水平升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，苏木提取物低剂量组、苏木提取物中剂量组、苏木提取物高剂量组ICAM-1、VCAM-1水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）（图3）。

表2 各组小鼠血清ICAM-1、VCAM-1水平比较（±s，ng·mL-1，n=10）

表2 各组小鼠血清ICAM-1、VCAM-1水平比较（±s，ng·mL-1，n=10）

注：**P＜0.01 vs Control group；#P＜0.05 vs Model group；##P＜0.01 vs Model group。

Group Control Model Low-dose SEAE Medium-dose SEAE High-dose SEAE ICAM-1 1.32±0.12 4.44±0.33**4.01±0.17#3.13±0.29##2.76±0.19##VCAM-1 1.18±0.10 2.71±0.42**2.18±0.14#1.95±0.13##1.73±0.14##

图3 各组小鼠血清ICAM-1、VCAM-1水平比较

2.3 对小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影响

如表3所示：与空白组比较，模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，苏木提取物低剂量组、苏木提取物中剂量组、苏木提取物高剂量组TC、TG、LDL-C降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（图4）。

图4 各组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平比较

表3 各组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平比较（±s，mmol·L-1，n=10）

表3 各组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平比较（±s，mmol·L-1，n=10）

注：**P＜0.01 vs Control group；#P＜0.05 vs Model group；##P＜0.01 vs Model group。

Group Control Model Low-dose SEAE Medium-dose SEAE High-dose SEAE TC 8.46±0.33 17.54±0.42**17.15±0.25#15.64±0.31##15.35±0.33##TG 1.31±0.10 3.85±0.15**3.69±0.14#3.37±0.16##3.32±0.16##LDL-C 6.74±0.17 13.60±0.28**13.44±0.39 13.30±0.20#13.29±0.22#HDL-C 1.21±0.06 1.16±0.10 1.17±0.09 1.19±0.09 1.19±0.08

2.4 对小鼠主动脉p38MAPK、NF-κB蛋白表达的影响

如表4所示：与空白组比较，模型组p38MAPK、NF-κB蛋白表达水平升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与模型比较，苏木提取物低剂量组、苏木提取物中剂量组、苏木提取物高剂量组p38MAPK、NF-κB蛋白表达水平降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（图5）。

图5 各组小小鼠主动脉p38MAPK、NF-κB蛋白表达比较

表4 各组小鼠主动脉p38MAPK、NF-κB蛋白表达比较（±s，n=10）

表4 各组小鼠主动脉p38MAPK、NF-κB蛋白表达比较（±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs Control group；#P＜0.05 vs Model group；##P＜0.01 vs Model group。

Group Control Model Low-dose SEAE Medium-dose SEAE High-dose SEAE p38MAPK/GAPDH 0.316±0.012 0.900±0.013**0.819±0.013##0.722±0.014##0.702±0.011##NF-κB/GAPDH 0.346±0.014 0.972±0.029**0.949±0.014#0.862±0.018##0.715±0.018##

3 讨论

建立动物模型目的是用于疾病的防治，为了更好地服务临床，进而为人类健康保驾护航。而AS模型的合理建立有利于深入研究其发病机制，可以丰富我们对这一类疾病的认识，以便发掘更好的治疗方案。常用的动物模型主要包括大鼠、家兔、灵长类动物、猪及基因敲除小鼠等，但由于动物模型是模拟原型，所以优化动物模型对于进一步深入探讨AS的发生发展具有重要的作用。目前，鼠类依然AS动物模型研究最多的动物，尤其基因敲除小鼠，具有AS模型成模周期短，模型稳定等诸多优点。载脂蛋白E（ApoE）是极低密度脂蛋白（VLDL）、乳糜微粒（CM）等重要的组成成分，缺乏ApoE会引起胆固醇在血管壁不断堆积，进而使得血管壁增厚硬化，弹性减少，甚至引起管腔狭窄，极易促使AS的发生，目前，ApoE-/-基因敲除小鼠作为最为经典AS动物模型之一，不仅因其可自发形成动脉粥样硬化病变，更为重要的是ApoE-/-小鼠病理改变与人类II型高脂血症极为相似，并且AS斑块主要好发于主动脉弓、主动脉瓣、胸主动脉等主动脉及其分支，晚期AS斑块易出现钙化等情况，非常符合临床AS患者病变特征，故被广泛运用于冠心病、高脂血症等疾病的研究。

中医学多将AS归属于“胸痹”的范畴，认为动脉斑块的形成，主要在于血液运行不畅、痹阻不通，如《素问》中记载“痹在于脉则血凝而不流”，较为清晰的阐述了血液滞涩不通为脉痹总的病因病机。并认为动脉粥样硬化是冠心病的病变基础，所以及时正确的防治对于预防、甚至延缓冠心病的发生具有重要的意义，而中医药对于预防和治疗动脉粥样硬化具有显著的作用，且安全性较高。苏木为豆科云实属植物苏木的干燥心材，又名赤木、苏杨、苏枋，首载于唐代苏敬等人所著的《新修本草》[18-19]。具有舒经活络、活血散瘀、消肿止痛等功效，临床上主要用于治疗心腹疼痛、瘀滞肿痛、跌打损伤、痈肿疮毒、血滞经闭、痛经及产后瘀阻腹痛等病症[20]。关于苏木的药物成分国内外学者进行了更为深入的研究，但由于苏木的化学成分较为复杂，目前仅仅从苏木的心材中分离鉴定出大约120个化合物，而其中，又尤以巴西苏木素含量最高，是苏木化学成分的主要类型，也是目前苏木药材的质控的主要成分[21]。现代药理学研究表明苏木具有免疫抑制、抗炎、抗心脏移植排斥反应、保护血管、抑制淋巴细胞、抗氧化、抗肿瘤等多方面作用[22]。本研究结果显示苏木能够降低小鼠血清中IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及TC、TG、LDL-C水平。综合上述文献及本研究结果再次证实了苏木具有抗炎、降低血脂等方面的作用，进一步为苏木防治AS提供可靠的理论依据。

AS是一类慢性炎症性疾病，最早由Ross提出[23]，并认为在AS发病的全过程各种炎症细胞和炎症介质均参与其中。但是，现阶段人们对于这种慢性低度的炎症具体的发病机制缺乏认识，同样对于治疗也缺乏有效的治疗方案，因此，深入研究炎症相关机制将对于AS的防治具有重要的意义。研究表明，MAPKs在哺乳动物细胞内广泛存在，被认为是炎症反应中一种重要的激酶，在调控炎症反应周期、调节细胞生长及分化等生理过程中起到关键的作用，其中，p38MAPK是其家族中最重要的成员之一，其活化后可以促使白细胞不断地发生聚集，进而引起或放大炎症反应，而一旦阻断p38MAPK的活化便可以缓解炎症反应[24-25]。NF-κB是真核细胞内一种重要的转录因子，研究表明，NF-κB的表达与MAPK信号通路密切相关，为p38MAPK的下游通路，活化的p38MAPK能够引起NF-κBp65磷酸化，而一旦NF-κB活化后便可以多种炎症因子、黏附分子的释放，如IL-6、IL-1β、TNF-α、细胞间黏附分子（ICAM-1）及血管细胞黏附因子（VCAM-1）等，进而引起多种免疫炎症反应[26-28]。IL-1β在AS发生发展中具有重要作用，研究表明，当Apo E-/-小鼠敲除IL-1β后可以延缓AS的进展，同样，与正常人比较，冠心病患者体中IL-1β水平明显升高[29]。TNF-α亦参与了AS的形成，研究表明，TNF-α可通过介导内皮细胞损伤、促进凝血、抑制纤溶等途径促进平滑肌细胞增殖、迁移从而引起AS的发生[30]。ICAM-1属于免疫球蛋白家族，通常情况下其很少表达，而在炎症因子的刺激下ICAM-1表达会明显升高，进而促进内皮细胞和单核细胞两者的黏附，促进炎症反应，诱发AS的发生发展，研究表明，ICAM-1、VCAM-1与AS早期斑块的进展密切相关，同时和AS的严重程度成正比[31]。同样，脂质代谢紊乱作为AS独立的危险因素，是AS的病理基础，已被证实TC、TG、LDL等水平的升高与AS呈正相关，而HDL水平与AS发病呈负相关[32-33]。

本研究在体内实验中，结果显示：与空白组比较，模型组小鼠血清中IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及TC、TG、LDL-C水 平 升 高，同 样，主 动 脉 中p38MAPK、NF-κB蛋白表达亦升高；与模型组比较，苏木提取物低、中、高组小鼠血清中IL-1β、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及TC、TG、LDL-C水平降低，主动脉中p38MAPK、NF-κB蛋白表达降低。初步说明了苏木提取物能够抑制炎症因子、黏附分子及血脂的表达水平，同时下调p38MAPK/NF-κB信号通路的表达。即苏木提取物能够通过抗炎、降血脂等途径发挥抗AS的作用，部分机制可能与抑制p38MAPK/NF-κB信号通路活化有关。