硫化氢浓度对盐胁迫下胡枝子种子萌发和幼苗生长的影响

王开喜，杨耀国，王永新，马 春，张亚慧

（山西农业大学 草业学院，山西 太谷 030801）

达乌里胡枝子是豆科多年生灌木，营养成分高，可制作青干草和优质青贮饲草料，是良好的水土保持植物和固沙植物[1]。达乌里胡枝子广泛分布在我国的华北、东北和西北等地区，但这些地区往往是一些土壤盐渍化地区[2]，因此，达乌里胡枝子生长时往往会遭受到盐分等逆境胁迫。有研究表明，达乌里胡枝子在种子萌发和苗木早期生长发育阶段均对盐分胁迫敏感[3]，在高盐胁迫下，达乌里胡枝子种子萌发率、发芽势、种子强度和发芽指数都有明显的下降；胚芽和胚根的高度和长度普遍变短[4]。所以，在盐分胁迫下，胡枝子种子能否正常发芽是判断植株在盐碱环境能否正常生长的重要前提条件[5]。为了增加种子的抗逆性，人们通常对种子进行预处理[6]。所以，通过研究盐胁迫条件下增高达乌里胡枝子种子活力的适宜浸种剂及其适宜的浓度，对达乌里胡枝子生产具有重要的实践意义。

硫化氢（H2S）是近年来在野生动植物体中发现的第3种气体信息分子，它不仅参与植物生长发育和生理代谢的调节，还可以提高植株对盐胁迫[7-8]、干旱胁迫[9]等各种逆境的抵抗[10]。有研究表明，NaHS浸种预处理能显著缓解NaCl胁迫（100 mmol/L）对苜蓿种子萌发和幼苗生长的抑制作用，并且可以提高根部K+/Na+的值，从而增强苜蓿对盐胁迫的适应能力[11]。还有研究发现，硫氢化钠能够有效缓解盐胁迫造成的水稻生长抑制，包括能缓解盐胁迫对水稻根长、株高的抑制影响以及盐胁迫下水稻生物量的减少，并且对水稻根系的形态建成有一定影响[12]。刘锐锋等[13]研究表明，经H2S加工过的麦类种子，在萌芽早期促使细胞分裂，可以有效促进种子的萌发。李东波等[14]研究表明，经0～40 μmol/L浓度的NaHS水溶液浸种过的豌豆种子进行播种，能够提高其胚根的生长发育，同时根尖边缘细胞的存活率也明显提高。王燕琴[15]研究表明，利用H2S促使内源一氧化氮（NO）的生成来减缓盐胁迫对紫花苜蓿种子萌发的抑制作用。鲍敬等[16]研究表明，相当含量的外源H2S可以减少NaCl胁迫对小麦种子萌发和幼苗生长发育的控制。对于外源H2S缓解盐胁迫下达乌里胡枝子种子萌发的研究未见文献报道。

本试验以达乌里胡枝子为供试材料，通过直接用NaCl模拟盐分胁迫抑制种子萌发，深入探究各种H2S浓度处理对盐胁迫下达乌里胡枝子种子萌发和幼苗生长的影响，旨在为研究外源H2S在达乌里胡枝子耐逆培育中的合理使用提供帮助。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为晋农1号达乌里胡枝子，现储存在山西农业大学草业学院的种质资源库中。H2S的供体是硫氢化钠。

1.2 试验方法

试验于2021年6月在山西农业大学牧站草学实验室内完成。

1.2.1 盐分胁迫的半致死浓度 选取籽粒饱满、圆润均一且整齐健壮的达乌里胡枝子种子，用1%的次氯酸钠消毒灭菌10 min，蒸馏水清洗3遍后干燥备用。以NaCl水溶液模拟盐分的胁迫，把种子摆放在垫有2层滤纸的培养皿中，分别加0、25、50、75、100、125、150、175、200 mmol/L NaCl溶 液4 mL（分别标记为Y0、Y25、Y50、Y75、Y100、Y125、Y150、Y175和Y200）。将培养皿放置于人工气候箱（RCL-P1000）中，发芽温度要求（25±2）℃，光/暗（16 h/8 h）交替培育，并且每天定量补充水分，保持培养皿中盐含量的相对稳定。每个处理50粒种子，每个处理4次重复。

1.2.2 NaHS处理达乌里胡枝子种子 种子的萌发试验采用纸上发芽法完成。胡枝子种子消毒灭菌10 min，蒸馏水冲洗3遍，干燥后备用。设7个NaHS处理即0、25、50、100、200、400、800 μmol/L NaHS溶液（分别记为CKP（进行盐胁迫）、T25、T50、T100、T200、T400和T800），在常温及黑暗条件下浸种18 h，对照组（CKT，不进行盐胁迫）用蒸馏水浸种18 h。分别选籽粒饱满、圆润均一且用不同浓度NaHS溶液浸种过的达乌里胡枝子种子50粒，摆入150 mmol/L NaCl溶液完全浸透的垫有2层滤纸的培养皿中，置于培养箱温度（25±2）℃，光/暗（16 h/8 h）交替培育，进行发芽试验10 d，每天定量补充水分。

1.3 测定指标及方法

发芽期间每天记录种子的萌发数量，以胚根突破2 mm为标准；试验进行第5天开始计算发芽势，第10天统计并计算发芽率，共记录10 d[17]。第10天完成发芽试验后，在每个培养皿中随机选取有代表性幼苗10株，用游标卡尺测量根长和苗高，然后分别算平均高度；再从每个培养皿中随机选取代表性幼苗10株，用电子天平称量新鲜质量，然后完全浸入蒸馏水中6 h，称量饱和鲜质量，后在电热恒温干燥箱中105℃杀青30 min，在65℃下烘干至恒质量，用电子天平称量干质量。

式中，Dn为发芽天数；n为每天新发芽的相应数量。

相对含水量=（鲜质量—干质量）/饱和鲜质

1.4 数据分析

利用Excel 2007应用软件开展大数据统计分析，用SPSS 22.0应用软件进行单因素方差分析（ANOVA），用Origin 2021作图。

2 结果与分析

2.1 达乌里胡枝子种子盐胁迫的半致死浓度分析

由图1可知，由于NaCl含量的增加，达乌里胡枝子种子的发芽率呈先升高后降低的趋势。当NaCl浓度上升到25 mmol/L时，相比于Y0，有上升的态势，表明了在0～25 mmol/L NaCl浓度处理下，能促进达乌里胡枝子种子的萌发。当NaCl浓度超过25 mmol/L时，种子萌发速率呈减少趋势。150 mmol/L NaCl处理下的达乌里胡枝子种子发芽率约为Y0的1/2。因此，盐胁迫半致死浓度150 mmol/L NaCl作为达乌里胡枝子种子萌发的盐胁迫浓度。

图1 盐胁迫对达乌里胡枝子种子发芽率的影响Fig.1 Effects of salt stress on germination percentage of seeds of Lespedeza davurica

2.2 外源NaHS浸种对盐胁迫下达乌里胡枝子种子发芽率和发芽势的影响

不同浓度NaHS浸种预处理对盐胁迫下达乌里胡枝子种子的萌发具有不同程度的影响。从图2可以看出，用NaHS浸种后达乌里胡枝子种子的发芽率相对于CKP均有所提高。在150 mmol/L NaCl胁迫下，50 μmol/L的NaHS可使达乌里胡枝子种子发芽率达到最高，为78.87%；而高浓度（800 μmol/L）NaHS的处理效果最差，发芽率仅为46.43%，略高于CKP，且差别不明显。与CKP相比，同等施用浓度的NaHS处理均能提高种子的发芽率，大部分处理组合的发芽率显著升高（P＜0.05），以50 μmol/L NaHS处理效果最佳。

图2 外源H2S对盐胁迫下达乌里胡枝子种子发芽势和发芽率的影响Fig.2 Effect of exogenous H2S on germination potential and germination percentage of seeds of Lespedeza davurica under salt stress

在150 mmol/L NaCl胁迫下达乌里胡枝子种子发芽势显著降低，是没有盐胁迫CKT处理的50.23%（P＜0.05）。不同浓度NaHS处理减缓了盐胁迫对种子发芽势的影响；且随NaHS浓度的增加，达乌里胡枝子种子发芽势呈先升高后降低的趋势。50 μmol/L NaHS处理的种子发芽势最高，和CKT最为相近。25、50、100、200、400 μmol/L NaHS处理都显著缓解了盐胁迫对种子发芽势的影响，都与CKP之 间 差 异 显 著（P＜0.05），800 μmol/L NaHS处理的发芽势最低，且与CKP相比没有显著差异（P＞0.05）。可以看出，50 μmol/L NaHS处理显著缓解了盐胁迫对达乌里胡枝子种子发芽势的影响（P＜0.05），较CKP增加了34.07%。

2.3 外源NaHS浸种对盐胁迫下达乌里胡枝子种子发芽指数和平均发芽时间的影响

由图3可知，经适宜浓度NaHS浸种后的达乌里胡枝子种子发芽指数均显著高于对照组CKP（P＜0.05）。在胁迫条件下，50 μmol/L NaHS处理的种子发芽指数达到最高，比对照组CKP提高了37.54%；当NaHS浓度为400～800 μmol/L时，各处理间发芽指数与CKT相比差异不显著。在强胁迫条件下，随着NaHS浓度增加，种子发芽指数呈前升高后降低的趋势，且均超过了对照组CKP，当NaHS浓度为50 μmol/L时，其发芽指数与对照组CKP差异最突出（P＜0.05），当NaHS浓度为25、100、200 μmol/L时，其发芽指数与对照CKP差别显著（P＜0.05）。400、800 μmol/L NaHS处理的发芽指数与对照CKP差异不显著。说明25、50、100、200 μmol/L NaHS均能不同程度地增高种子的发芽指数，且50 μmol/L NaHS处理效果最好。

图3 外源H2S对盐胁迫下达乌里胡枝子种子发芽指数和平均发芽时间的影响Fig.3 Effects of exogenous H2S on germination index and average germination time of seeds of Lespedeza davurica under salt stress

在盐胁迫条件下，经不同浓度NaHS处理后，达乌里胡枝子种子平均发芽时间与对照组CKP相比均缩短，与CKP差异显著（P＜0.05），在25～800 μmol/L NaHS处理下，T25～T800处理间差异不显著，说明在不同浓度NaHS处理下达乌里胡枝子的发芽时间基本一致；与CKP相比，NaHS处理的浓度范围内均缩短了发芽时间。

2.4 外源NaHS浸种对盐胁迫下达乌里胡枝子幼苗相对含水量的影响

盐分胁迫下，添加NaHS可提高达乌里胡枝子幼苗的相对含水量。从图4可以看出，在150 mmol/L盐胁迫下50 μmol/L NaHS处理下的相对含水量最高，为78.56%，与对照组（CKP）差异显著（P＜0.05），800 μmol/L NaHS处理下效果最差。不同浓度NaHS处理下，其相对含水量呈现先增加后降低的趋势；T25和T100～T400处理下与对照组CKP相比差异显著（P＜0.05）；T800处理与对照组CKP间差异不显著，说明在25～400 μmol/L NaHS浓度内都显著提高了达乌里胡枝子相对含水量，且以50 μmol/L NaHS处理效果最好。

图4 外源H2S对盐胁迫下达乌里胡枝子幼苗相对含水量的影响Fig.4 Effects of exogenous H2S on relative water content of Lespedeza davurica seedlings under salt stress

2.5 外源NaHS浸种对盐胁迫下达乌里胡枝子幼苗苗高和根长的影响

由图5可知，一定浓度NaHS可以提高达乌里胡枝子在盐胁迫下的苗高和根长。在盐胁迫条件下，经25、50、100 μmol/L NaHS处理后，达乌里胡枝子幼苗高度和根长与对照组CKP相比均差异显著（P＜0.05）；当NaHS浓度为25～100 μmol/L，幼苗高度比对照组CKP分别提高了15.24%、23.16%和16.37%（P＜0.05），幼苗根长比对照组CKP分别提高了11.64%、15.80%和13.17%；当NaHS浓度为200～800 μmol/L时，幼苗高度和根长与对照组CKP差异不显著。因此，200～800 μmol/L NaHS浸种效果不佳；25～100 μmol/L NaHS浸种效果较明显，且50 μmol/L NaHS效果最明显。

图5 外源H2S对盐胁迫下达乌里胡枝子幼苗苗高和根长的影响Fig.5 Effects of exogenous H2S on seedling height and root length of Lespedeza davurica seedlings under salt stress

3 结论与讨论

盐分胁迫会不断转变为渗透胁迫，影响活性氧代谢的同时也不断使植株体内离子失衡，使植株机体内部的水分不能正常的保持，细胞膜透性的功能与结构不断遭到破坏，阻止植株的生长发育和繁殖，最终导致死亡[18]。在本试验中，针对不同浓度NaCl处理对达乌里胡枝子种子产生相应的萌发机制可知，150 mmol/L NaCl胁迫的发芽率约为Y0的1/2（半致死浓度），因此，本试验选择了150 mmol/L作为本试验的胁迫浓度。

有研究表明，外源H2S可以有效减缓盐胁迫，它是一种气体信号分子，可以提高植物对环境的耐受能力[19]。本试验通过外源NaHS浓度倍增的方式来减缓达乌里胡枝子种子萌发和幼苗生长在盐胁迫下的危害。发芽率、发芽势反映出了种子萌发的同步程度和均匀程度[20]。本研究表明，不同浓度外源H2S处理在盐胁迫下的发芽率、发芽势存在差异，与CKT相比，盐胁迫后的达乌里胡枝子种子发芽率和发芽势差异显著并明显下降；将种子经过NaHS浸种预处理之后，达乌里胡枝子种子的发芽率和发芽势均有不同程度的提高，25～400 μmol/L NaHS处理组的发芽率和发芽势均显著高于盐胁迫下没有经H2S的处理组，说明低浓度的外源硫化氢对达乌里胡枝子的发芽率和发芽势有促进作用，而高浓度800 μmol/L NaHS处理促进作用不明显，其中以50 μmol/L NaHS浸种预处理效果最好，也进一步说明低浓度的硫化氢可能促进种子内部某种酶的活性或者提高了某种物质的含量，还需要进一步的研究。这与外源H2S可以促进盐胁迫下西葫芦发芽的事实相符合[21]。

胡枝子种子的发芽指数与平均发芽时间综合反映出了种子的生命力与萌发速率，是种子活力的大小和耐性的体现[22-23]。刘建新等[10]研究指出，外源H2S可以有效减缓盐分胁迫，从而提高裸燕麦种子的发芽指数，减少了平均发芽时间。本试验的研究结论也与此相符，不同外源H2S处理对种子的发芽指数影响差别明显，与CKT相比，150 mmol/L NaCl浓度下达乌里胡枝子种子的发芽指数显著降低，平均发芽时间延长，且经NaHS浸种处理后，与CKP相比，T25～T200处理下的达乌里胡枝子种子发芽指数显著提高。说明硫化氢缓解盐胁迫的效果不仅与硫氢化钠浓度有关，也产生相应的剂量效应机制。T25～T800处理则大大缩短了平均发芽时间，且无差异性。这可能是由于外源硫化氢在没有浓度剂量效应的前提下，与盐胁迫抗衡，触发某种机制，缩短了平均发芽时间，还需要进一步的试验论证。

胡枝子幼苗的相对含水量反映了植株体内水分的多少，会因盐胁迫的抑制而减少[24]，从而引起渗透胁迫。本研究表明，与CKT相比，盐胁迫下未经H2S处理的达乌里胡枝子幼苗相对含水量显著下降（CKP），而用不同H2S处理后，T25～T200 H2S处理组均高于CKP且差异显著，并且不同程度地提高了达乌里胡枝子幼苗的相对含水量，T50处理最佳。这与符姿[25]研究外源H2S和NO可以提高盐胁迫下苇状羊茅幼苗的相对含水量研究结论相同，说明经过一定浓度H2S处理后，达乌里胡枝子幼苗可以维持相当的水分，减缓盐胁迫的抑制并促进达乌里胡枝子幼苗正常的生长发育和繁殖。

苗高和根长在种子萌发过程中扮演着极其重要的角色，它们是反映幼苗生长发育与繁殖情况的重要衡量标准。本试验表明，150 mmol/L NaCl处理后的种子幼苗苗高和根长都显著下降，25、50、100 μmol/L NaHS处理可显著缓解盐胁迫对苗高和根长的伤害。李东波等[14]研究表明，经0～40 μmol/L NaHS溶液浸种后，可以促进豌豆胚根的正常生长和发育，根尖细胞存活率也显著提高；刘锐锋等[13]研究发现，经50 μmol/L NaHS处理过的小麦种子，在萌发早期促进细胞分裂，可以有效促进种子的萌发和幼苗生长。本试验结果与之相似，以50 μmol/L NaHS处理效果最佳。说明盐胁迫对植物的生长具有抑制作用，表现为一系列代谢生理活动的变化最终形成外部形态的变化。但一系列的代谢生理活动需要后续的研究来支撑外部形态建成的变化。本试验也进一步说明硫化氢缓解盐胁迫的效果不仅与硫氢化钠浓度有关，也产生相应的剂量效应机制。

本研究表明，在25～100 μmol/L NaHS浸种中均可以不同程度地减缓由150 mmol/L NaCl引起的达乌里胡枝子种子发芽率、发芽势、发芽指数、平均发芽时间、相对含水量、根长和苗高产生的抑制作用，其中，50 μmol/L NaHS浸种预处理效果最佳。