尿液膀胱肿瘤标志物的研究进展

杨礼宾 许汉标

1广东医科大学第一临床医学院，湛江 524023；2惠州市第二妇幼保健院综合外科，惠州 516000

膀胱癌在世界常见肿瘤中排第9 位，在美国成年男性常见癌症中排第4 位［1］。约80%的膀胱癌初诊时为非肌层浸 润 性 膀 胱 癌（non-muscular invasive bladder cancer，NMIBC），其余20%为肌层浸润性膀胱癌（muscular invasive bladder cancer，MIBC）。大多数 NMIBC 将经历肿瘤复发［2］，其中10%～30%将进展为MIBC［3］。因此，肿瘤的早期诊断和复发监测在患者管理中具有重要意义。目前，膀胱癌的诊断主要依靠膀胱镜和尿细胞学检查，前者为侵入性检查，易给患者带来不适；后者主要的局限性是检查结果存在主观性，且对低级别膀胱癌的灵敏度较低［4］。因此，急需探索具有高灵敏度、高特异度、低成本、非侵入性的膀胱癌尿液生物诊断标志物。美国食品和药物监督管理局（FDA）已经批准包含尿膀胱肿瘤抗原（bladder tumor antigent，BTA）、核基质蛋白22（NMP22）等多种尿液检测方法用于临床协助膀胱癌的诊断。然而，出于种种的局限性，在美国泌尿外科协会或欧洲泌尿外科协会临床指南中，这些检测方法都没有在临床实践中常规推荐使用。本文旨在综述尿液生物标志物在膀胱癌中的应用现状，同时介绍基于DNA、RNA、尿液中的肿瘤微环境成分等新型分子“液体活检法”的研究进展。

FDA已批准用于临床的膀胱癌尿液生物标志物

1、BTA STAT/BTA TRAK

BTA 是人补体因子-H 相关蛋白（HCFHrp），它存在于膀胱癌细胞中，可以抑制补体级联反应，防止细胞溶解。检测方式包括BTA STAT 和BTA TRAK 两种方法，BTA STAT是定性检测，而BTA TRAK 是定量酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。虽然都已被FDA 批准用于诊断和监测膀胱癌复发，但仅作为膀胱镜检查的辅助手段。一项荟萃分析显示，BTA STAT 和BTA TRAK 检测的灵敏度分别为64%［95% 置信区间（CI）58%～69%］和 65%（95%CI54%～75%），特异度分别为 77%（95%CI73%～81%）和 74%（95%CI64%～82%）［5］。然而，BTA 的检测结果易受血尿、炎症、结石等因素影响，所以假阳性率较高［6］。

2、NMP22

NMP 是一种细胞内的非染色质结构，负责调节DNA 复制、转录和 RNA 加工［7］，NMP22 在膀胱癌细胞中呈高表达，当肿瘤细胞发生凋亡后会将其释放入尿液中，因此可在尿液中检测到。NMP22 检测包括定量ELISA 和定性检测，两者均可辅助膀胱癌诊断和监测复发。先前的研究表明，定量NMP22 测定对原发性膀胱癌诊断的灵敏度为44%～100%，特异度为60%～95%［8］。2017年，南京医科大学第一附属医院 Wang 等［9］对 19 项关于 NMP22 定性检测的研究进行了单独荟萃分析，其中包括5 291 例患者测试结果，最后的灵敏度为52%～59%，特异度为87%～89%。像许多其他生物标志物一样，NMP22 在低级别肿瘤检测中灵敏度特别低［5］。另外，在合并炎症、结石、血尿时假阳性结果也很常见。

3、UroVysion

UroVysion 膀胱癌试剂盒是一种多色荧光原位杂交（FISH）分析手段，旨在评估染色体3、7 和17 的非整倍体或9p21 位点的丢失。这项检测的灵敏度在69%～87%之间，特异度在89%～96%之间［10］。同样，最近的荟萃分析（共纳入11 项研究）显示其灵敏度和特异度分别为63%（95%CI50%～75%）和87%（95%CI79%～93%）［11］。另一项研究表明，相同情况下该试剂盒检测到的NMIBC 几乎是尿细胞学检查结果的2 倍，而且对MIBC 的检出率高达88%，尿细胞学检查则漏掉了其中32%的MIBC［12］。本试验特异度高，优于NMP22 和BTA 试验。该分析不受血尿、泌尿系感染或其他可能导致荧光假阳性情况的影响。此外，大多数证据表明UroVysion 试验在预测膀胱癌对卡介苗的灌注治疗反应方面发挥了重要作用［13］。

FDA未批准用于临床的膀胱癌尿液生物标志物

1、DNA相关尿液生物标志物

1.1、DNA 甲基化 肿瘤患者最典型的表观遗传现象是DNA 甲基化［14］。在膀胱癌和一些癌前病变患者中发现了DNA 的高甲基化和低甲基化区域［15］。DNA 甲基化状态可以通过尿液中的游离DNA 片段和肿瘤脱落细胞来评估。与良性病例相比，肿瘤患者的甲基化基因（如APC和细胞周期蛋白D2）含量显著升高［16］。已在膀胱癌患者中发现包括GSTP1、APC 和 RARb2 在内的特定基因的高甲基化［17］。表1 概括了近些年来主要的DNA 甲基化相关尿液生物标志物及其灵敏度和特异度。虽然这些标志物的特异度令人较为满意，但检测这些标志所需的分子遗传学技术比较费时、费钱、费力。

表1 膀胱癌相关DNA甲基化尿液生物标志物（%）

1.2、微卫星分析 微卫星是人类基因组中长度为1～6个碱基对的重复核酸序列单位，微卫星分析主要针对这些较短、多形性DNA 串联重复序列。膀胱癌最常见的遗传变化之一是9 号染色体杂合性丢失［25］。染色体4p、8p、9p、11p和17p 在膀胱癌患者中也经常表现为杂合性丢失。一般来说，这些标志物的灵敏度在72%～97%之间，总体特异度在80%～100%之间［26-27］。微卫星杂合性缺失分析在诊断分级分期较低的膀胱癌方面比单纯尿细胞学更敏感（97%比79%），对低级别膀胱癌的灵敏度为95%，对原位癌和其他高级别膀胱癌的灵敏度为100%［28］。

2、RNA相关尿液生物标志物

2.1、微小 RNA（miRNA） miRNA 是一种长为 21～23 个核苷酸的非编码RNA，它通过与其靶mRNA 的3‘非翻译区配对来调节基因的表达。它们在体液中可以以自由循环的miRNA 形式存在，也可以与核糖核蛋白复合体结合，或者以外泌体的形式存在于胞外小泡中［29］。肿瘤组织中miRNA 的表达表现出组织特异性，具有很高的稳定性和可检测性。由于其序列较短，miRNA 比mRNA 链更不容易降解，并且可以在室温下保存长达48 h。因此，miRNA 表达分析被认为是一种潜在的诊断和监测生物标志物。Kutwin等［30］研究成果表明，尿上清液miRNA 灵敏度最高（78.4%），其次是尿沉渣（75.6%）和尿液原液（74.3%）；尿液上清液的特异度也是三者中最高的，为79.4%。当然，尿液中miRNA水平也可作为预测NMIBC复发的预后标志物。Kim 等［31］研究发现，在术后随访结局为复发的NMIBC 患者中，尿miRNA-214 表达下调，与未复发的患者相比，HR为2.011（95%CI1.027～3.937）。所以，不管是尿液单一miRNA 检测还是多种miRNA 联合检测，未来作为膀胱癌的潜在诊断标志物还是很有研究前景的。

2.2、长链非编码RNA（lncRNA） 随着对lncRNA 研究的不断深入，其也逐渐成为膀胱癌诊断的手段之一［32］。得益于高通量二代测序技术（next generation sequencing，NGS）的出现，目前已经分离鉴定出10 000 多个独特的lncRNA，并阐明了它们的生物学功能。lncRNA 通过调节参与细胞转化的信号通路，在膀胱癌肿瘤的发生中起着至关重要的作用［33］。张争等［34］研究了在膀胱癌患者尿液中发现的一种命名为尿路上皮癌癌胚抗原1（UCA1）lncRNA 的潜在应用价值，中国药科大学药物科学研究所张本佳等［35］也对此做出了相关报道。结果表明，UCA1诊断膀胱癌的灵敏度和特异度分别为84.4%和92.4%（AUC=0.898）。此外，该研究还强调了UCA1 作为NMIBC 患者预后生物标志物的作用，预测NMIBC 进展为MIBC 的灵敏度为86.4%；特异度为92.3%。同样，Eissa等［36］的研究表明UCA1对检测膀胱癌有较高的灵敏度（91.5%）和特异度（96.5%）。结果表明，在NMIBC 患者中，尿UCA1 比尿细胞学检查更准确。另一项初步研究在90.5%的膀胱癌患者和25.9%的健康对照者的尿沉渣中检测到lncRNA H19，使其成为膀胱癌诊断的辅助工具［37］。虽然其他lncRNA 的表达也与膀胱癌相关，但大多数研究都是基于组织或细胞；因此，结果需要在尿液中进行验证，以确认它们作为非侵入性膀胱癌生物标志物的适用性［38-39］。

3、尿液中的肿瘤微环境成分分析

Wong等［40］最近的1份包含32例MIBC 患者的研究报告发现，尿液中的淋巴细胞是很好的膀胱癌生物标志物来源；尿液中的效应器CD8+和CD4+细胞以及调节性T 细胞准确绘制了肿瘤微环境的免疫检查点情形和T 细胞受体谱系。尿源性淋巴细胞数量的增加，尤其是NMIBC 肿瘤电切术后CD8+细胞上PD-1（PD-1hi）的高表达，与较短的无复发生存期有关。尿液淋巴细胞分析代表了膀胱肿瘤免疫微环境的动态液体活检，可作为研究MIBC预后价值和免疫治疗靶点的潜在手段。

总结与展望

膀胱癌尿液生物标志物检测领域发展迅速，但目前临床上还没有生物标志物可以完全替代膀胱镜和尿细胞学检查。最近发现的尿液蛋白质组、基因组、表观遗传组、转录和代谢组学中的一系列生物标志物，迫切需要通过多中心临床研究的广泛数据来进一步进行验证。缺乏临床实际测试、验证性研究有限、不同阳性阈值的确定、膀胱肿瘤异质性，以及不同组学之间的复杂相互作用，这些都是尿液生物标志物开发和验证中的一系列重要挑战。在未来，NGS 技术、高级人工智能和新颖临床试验模型的应用，可为尿液生物标志物的开发不断助力。另外，越来越多的证据表明，尿液中游离DNA、DNA 甲基化、miRNA、游离蛋白质/多肽和外泌体来源的核酸可作为尿液生物标志物，有助于鉴别MIBC和NMIBC 或评估治疗后的早期复发。最近有相关学者提出，通过分析京都基因与基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG），可用于发掘与膀胱癌形成有关的生物信号通路，可能有机会发现新的尿液生物标志物。此外，在不久的将来，将人工智能方法应用于尿液生物标志物分析和数据挖掘可能会加速研究的前进步伐。随着研究的进展，通过更先进的“纳米传感器”检测尿液中的RNA 和蛋白质也将逐渐成为现实，届时将改变现有的检测方法。尿路微生物群的改变（生物失调）也可能与膀胱癌的发生有关。最近有报道称，通过分析尿液外泌体中提取的DNA 发现，与对照组相比，膀胱癌队列中存在不动杆菌、厌氧球菌和鞘氨酸杆菌特异度富集的现象。在高危膀胱癌患者中观察到卟啉杆菌、枯草芽孢杆菌和类杆菌的增加，表明这些菌属可能是新的潜在生物标志物［41-42］。在未来的临床实践中，最有可能的应该是多种检测手段的联合应用，特别是基因组相关生物标志物与尿细胞学检查和新一代膀胱镜检查技术的结合使用，将大大提高膀胱癌的诊断准确性和早期发现复发进展。

作者贡献声明杨礼宾：酝酿和设计实验，实施研究，采集、分析/解释数据，起草文章；许汉标：对文章的知识性内容作批评性审阅，获取研究经费，行政、技术或材料支持，指导，支持性贡献