基于低场核磁共振技术快速测定油茶籽含油率

孔凡利，付宇新，王召滢，曹 冰,3，贺义昌，曾凡新，雷小林

（1.国家林业和草原局林草调查规划院，北京 100714；2.江西省林业科学院，江西 南昌 330013；3.江西农业大学林学院·江西省森林培育重点实验室，江西 南昌 330045）

油茶（Camellia oleifera）属山茶科山茶属植物，广泛种植于我国17个省（区）1 100多个县（市）,是我国重要的木本油料植物[1]。油茶的主要产品茶油——油茶种子榨出的油，是一种天然的优质保健食用油，与棕榈油、橄榄油和椰子油并称为世界四大木本植物油[2]。茶油的成分主要包括脂肪酸、维生素、山茶苷和茶多酚等，其中脂肪酸含量约为99%，主要包括油酸、亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸，棕榈酸、花生酸等饱和脂肪酸[3]。茶油的用途非常广泛，据报道，茶油具有预防心血管疾病、减少血液中的胆固醇、加强免疫系统、抑制肿瘤、抗炎等多种作用[4-5]。

目前，测定植物种子含油率的方法有比重法[6]、折光法[7-8]、索氏提取法[9-11]、核磁共振法[12-14]、近红外光谱法[15-17]等。索氏提取法是一种传统的含油率测定方法，也是目前GB/T 14488.1-2008《植物油料含油量测定》采用的测试方法，该方法主要通过提取种子中的油脂成分，然后称取残渣质量计算种子的含油率。索氏提取法普遍应用于常见的植物和食品的脂肪测定。尽管其精确度较高，但测定过程繁琐，提取时间长，一般达到了10 h以上；提取后抽提瓶不易恒重，待测的油料样品要进行充分粉碎。该方法还需要使用一定量低熔点易挥发有机试剂，如石油醚、乙醚、正己烷等，提取过程消耗大量的水、电。且实验误差大，效率低，综合成本高。因此，简便快捷、无毒无损、准确可靠的检测技术是提高油料植物种子含油率测定效率和加速植物良种选育的重要途径。

低场核磁共振技术（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）是一种快速、无损的油料植物种子含油率检测技术，在恒定磁场与交变磁场的作用下，1H、13C、31P、19F、15N、129Xe等具有固定磁矩的原子核，发生原子核的共振跃迁，与交变磁场发生能量交换的现象。其中，1H以其自然界中丰度高、核磁共振信号强、易于检测、便于观察、存在稳定等特点使1H NMR技术成为了目前应用最多的核磁共振技术。核磁共振法是通过检测样品中氢质子含量来计算样品的含油率，且其测试过程简便、快捷、无损、准确。在小籽粒类经济油料作物方面已有大量应用，但是在油茶、核桃等植物含油率检测方面少有报道。蔡坚等[18]用两种方法测定10份高州油茶种仁含油率，结果绝对偏差均小于2%，具有较好的对照性。刘喻娟等[19]用核磁共振法测定广宁红花油茶种仁含油率，得出该方法精密度高，稳定性好。

本研究采用NMI20低场核磁共振仪测定油茶干籽含油率，并与索氏提取法进行比较，旨在为油茶等油料植物种子含油率的快速测定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料：油茶籽样品采自江西省林业科学院油茶基地；定标茶油来源于茶油生产企业。

试剂材料：石油醚（60℃~90℃）（上海国药集团化学试剂有限公司）分析纯，实验超纯水（默克化工技术有限公司）。

仪器设备：NMI20低场核磁共振分析仪（苏州纽迈分析仪器股份有限公司），ME104E电子天平（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司），电热鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司），RE5298A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），HH-S6电热恒温水浴锅（金坛市恒丰仪器），SXT-06索氏提取器（四川蜀玻（集团）有限责任公司），高速粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），干燥器、冷凝管、滤纸筒和脱脂棉等。

1.2 试验方法

1.2.1 索氏提取法测定油茶籽含油率

称取粉碎好的均匀试样约5 g移入到滤纸筒中，将滤纸筒放入提取管内，连接冷凝管和圆底烧瓶，加入100 mL石油醚至圆底烧瓶中，在85℃水浴锅中加热回流6~8 h；随后取出滤纸筒，取下圆底烧瓶，回收石油醚；最后，将圆底烧瓶在100~105℃烘箱中烘干2 h，直至前后两次重量不超过0.0010 g为止，通过茶油质量计算含油率。

1.2.2 油茶籽油和水分定标

（1）油茶籽油定标曲线

称取纯茶油约50 g，放入温度设定为105℃的鼓风干燥箱内1.5 h，然后冷却至室温，备用。

根据油茶籽含油量预估茶油定标曲线范围，分别称量茶油3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.5 g并分别倒入专用定标测定管内（茶油质量梯度视油茶籽含油量而定），测定信号，定标。

（2）水分定标曲线

分别称量1 %（m/v）氯化锰溶液1.0 g，0.8 g，0.6 g，0.4 g，0.2 g，0.1 g，并分别倒入专用定标测定管内，测定信号，定标。

1.2.3 核磁共振法测定油茶籽含油率

称取油茶干籽样品约100 g，放入温度设置为105℃的烘箱干燥，直至样品含水率在10%以下，冷却至室温，随机称取4~8 g（精确到0.001 g）样品（样品量视样品籽粒大小而定），装入测定专用试管中，置于仪器测试区域，调用标准曲线，测定。

2 结果与分析

2.1 油茶籽油和水分定标曲线

通过连续2 d油茶籽油标准曲线和水分标准曲线测定，曲线拟合度均满足试验要求，具体见图1、图2和表1、表2。

表1 两次定标的油茶籽油含油率标准曲线Tab.1 Calibration curve of oil content of camellia seed oil

表2 两次定标的水分标准曲线Tab.2 Calibration curve of moisture

图1 油茶籽油含油率定标标准曲线Fig.1 Calibration curve of oil content of C.oletfera seed oil

图2 水分定标标准曲线Fig.2 Calibration curve of moisture

从油茶籽油和水分定标曲线结果来看，分别在不同日期测得的曲线拟合情况十分相近，油茶籽油两次拟合相关系数分别达到0.9998和0.9997，而水分拟合相关系数也达到了0.9998和0.9999，均达到0.999以上，符合测定要求。信号质量比数据方面，油茶籽油两次的最大信号质量比分别为1 460.346和1 451.531，水分两次的最大信号质量比分别为781.587和787.109，两者均十分接近，重现性较好。结合标准曲线的拟合相关系数以及核磁共振反馈的信号质量比数据比较分析，油茶籽油和水分定标曲线表现稳定，可重复性好，可以作为油茶籽含油率和水分测定使用。

2.2 索氏抽提法和核磁共振法的比较

取30份油茶籽样品，在105℃下烘干（含水率≤10%），冷却备用。每份样品先用核磁共振法测定含油率，再按照索氏提取法测定同一份样品，测定结果及偏差分析情况如图3、表3所示。

图3 30份油茶籽样品索氏提取法和核磁共振法测定含油率结果比较Fig.3 Comparison between SEM and NMR determination of oil content of 30 samples of C.oleifera seeds

由图3可知，30份样品2种方法含油率测定结果均十分接近，说明采用核磁共振法在一致的条件下测定含油率结果准确、可靠。表3的统计数据表明，30份样品2种方法之间的绝对偏差范围为0.02%~1.53%，均小于2%，相对偏差范围为0.07%~4.97%，均小于5%，由此可知两种方法具有较好的对照性。其中核磁共振法测定的油茶籽含油率结果大多数高于索氏提取法，可能的原因是核磁共振法测定的油茶籽含油量是包含其中脂肪酸和醇类等物质的氢质子信号总量，而索氏提取法无法将油脂样品中的脂肪酸和醇类等物质完全抽提出来。另外样品可能存在流动性的自由水氢质子对试验结果产生干扰。

表3 30份油茶籽样品索氏提取法和核磁共振法测定含油率结果对比Tab.3 Results of SEM and NMR determination of oil content of 30 samples of C.oleifera seeds

从两种方法的测定效率方面来看，传统索氏提取法测定含油率包含样品制备、回流提取、油脂回收浓缩干燥等过程，一般需要8~10 h，而使用核磁共振法可将单个样品测定时间缩短至5 min，测定效率大大提高，而且准确度高，非常适合进行大批量样品含油率的测定。

2.3 精密度检验

取油茶籽样品20份，采用低场核磁共振含油含水率分析软件测定样品含油率，每份样品重复测定7次，测定结果见表4，统计分析结果显示，20份油茶籽样品含油率结果标准偏差范围为0.10%~0.24%，均小于0.3%，变异系数范围为0.34%~0.91%，表明核磁共振法测定油茶籽含油率具有很好的精密度。

表4 20份油茶籽样品含油率重复7次测定结果Tab.4 Oil content of 20 samples repeated 7 times

2.4 稳定性检验

取油茶籽样品20份，采用低场核磁共振含油含水率分析软件测定样品含油率，每份样品称取7个不同质量（5.0~7.0 g）进行测定，测定结果见表5。统计分析结果显示，20份油茶籽样品7次测定的含油率变化范围小，测定结果较稳定。20份样品含油率结果标准偏差范围为0.58%~2.43%，均小于3%，变异系数范围为1.47%~9.14%，均在10%以内，表明核磁共振法测定油茶籽含油率的重现性好。

表5 20份油茶籽样品7次称量含油率测定结果Tab.5 Determination results of oil content of 20 samples after 7 times weighing

3 结论与讨论

核磁共振法测定含水率、含油率所依据的是样品中所含氢质子总量，通过油水的横向弛豫时间差，进行反演预测，而样品中水分过多则会导致水的横向弛豫时间接近于油，在反演过程中造成结果偏差。有研究表明核磁共振法测定样品含油率随水分含量的增加而提高，增加一定体积的水，样品中的氢质子含量相应增加，导致仪器测定结果也相应增大[18-20]。因此，测定时要严格控制样品中的含水量，样品必须干燥至含水率低于10%，降低过多的水分对测定结果的干扰。另外样品合理的测定质量范围在5.0~7.0 g之间，测定结果准确。

传统的索氏抽提法测定过程耗时长、操作繁琐、有机试剂和易耗品多、水电消耗大、测定效率低、人力成本高，还存在一定的实验安全隐患，而核磁共振法简便快速、无毒无损、准确可靠，本研究对核磁共振法和索氏提取法测定油茶籽含油率进行比较，核磁共振法不同时间定标油茶籽油和水分标准曲线的拟合相关系数均大于0.999，核磁共振信号响应值相近，油茶籽油和水分定标曲线表现稳定，可重复性好。两种方法测定的20份样品含油率结果比较，测定结果绝对偏差均小2%，平均相对偏差均小3%，表明核磁共振法测定结果准确可靠。从核磁共振测定方法的精密度和稳定性检验结果来看，核磁共振法测定油茶籽含油率的精密度高，稳定性好。因此，核磁共振法可作为一种快速、无损、准确测定油茶籽含油率的方法。