基于eNOS/NO信号通路探讨脑清通颗粒对肝热痰瘀证高血压大鼠的作用*

严亚锋，白海侠，周海哲

陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

高血压是最常见的心脑血管疾病之一，也是心脑血管病的首要危险因素，长期高血压会损害心、脑、肾等器官。研究表明，高血压的发病机制主要涉及血管内皮功能紊乱、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(rein-angiotensin-aldosterone-system，RAAS)失衡、交感神经系统激活、血管平滑肌细胞增殖、炎性反应等[1-2]，其中，内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) /一氧化氮(nitric oxide，NO)信号通路与高血压的发病机制密切相关[3-5]。脑清通颗粒是首届国医大师张学文教授多年临床实践凝练的经验方，处方包括决明子、丹参、川芎、 姜半夏等11味中药，具有清肝活血、涤痰通络的功效，主要用于治疗肝热痰瘀证高血压、中风病、头痛等[6]。课题组前期研究表明，脑清通颗粒治疗肝热痰瘀证高血压疗效确切[7-8]，但降压机制尚不清楚。本研究基于eNOS/NO信号通路探讨脑清通颗粒对肝热痰瘀证高血压大鼠的作用机制。

1 材料

1.1 动物70只6周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±10)g，由成都达硕实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(川)2020-030，合格证号：0043221。所有大鼠均分笼给予标准饲料适应性喂养1周，室温(22±2)℃，昼夜各12 h，自由饮水进食。本实验方案经陕西中医药大学动物实验伦理委员会审批通过，伦理批准号为：SUCMDL20210316001。

1.2 药物与试剂脑清通颗粒(陕西中医药大学附属医院制剂中心，规格：15 g/袋，批号：200601)；卡托普利片(山西津华晖星制药有限公司，规格：25 mg/片，批号：200104)；丙硫氧嘧啶片(上海朝晖药业有限公司，批号：1903N04)；黑顺片配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：200902)。环孢菌素A(上海源叶生物科技有限公司，批号：S17068)；注射用大豆油(浙江田雨山药用油有限公司，批号：19210KG)；二氨基联苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)试剂盒(丹麦DAKO公司，货号：K5007)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记山羊抗兔IgG抗体、RIPA裂解液、eNOS多克隆抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：GB23303、G2002、GB11086、G2014、G2026)；血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、内皮素-1(endothelin-1，ET-1)、eNOS试剂盒[艾莱萨生物科技(上海)有限公司，批号均为202101]；NO测定试剂盒(微板法，南京建成生物工程研究所，货号：A013-2-1)；精炼猪油(临沂经济技术开发区裕升食用油有限公司)；胆固醇、胆酸钠、吐温-80、丙二醇(河南万邦化工科技有限公司)。

1.3 仪器BP-300A型全自动大小鼠无创血压测量系统(成都泰盟软件有限公司)；RM2016型病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；A1型研究级正置数码显微镜(德国Zeiss公司)；DYCZ-24DN型电泳仪、DYCZ-40D型转膜仪(北京六一仪器厂)；Image J 1.8.0图像分析系统(美国国立卫生研究院)。

2 方法

2.1 高脂乳剂配制取80 g猪油、40 g胆固醇置500 mL烧杯中，加热融化后加入8 g胆酸钠和4 g丙基硫氧嘧啶，充分搅匀，加入80 mL吐温-80、120 mL 丙二醇及适量的蒸馏水，充分搅匀后加蒸馏水定容至400 mL并充分混匀，置4 ℃冰箱保存备用，用时加热融化。

2.2 大鼠分组、模型制备及药物干预随机从70只6周龄SPF级雄性SD大鼠中选取10只为正常组，其余60只大鼠按参考文献所述方法制备肝热痰瘀证高血压大鼠模型[6-7]，具体如下：采用环孢菌素A皮下注射加附子和高脂乳剂灌胃制备肝热痰瘀证高血压大鼠模型。测量大鼠基础血压后，以 5 mL·kg-1体积皮下注射25 mg·kg-1环孢菌素A后，以10 mL·kg-1体积灌胃给予高脂乳剂，最后以10 mL·kg-1体积灌胃给予2 g·kg-1附子溶液(黑顺片配方颗粒溶液)，每日各1次，每种给药间隔 1 h，连续给药14 d。当大鼠尾部平均收缩压(systolic blood pressure，SBP)与基础血压差值≥20 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，且高于115 mm Hg者，即可判定为高血压疾病模型建立成功[9]。当大鼠出现毛色晦暗、泛黄，易激惹，精神状态不佳，饮食减少，口中痰涎增多，嘴唇、舌质紫暗，大便秘结等中的4项及以上者，即可判定为肝热痰瘀证[10]。取造模成功的大鼠50只，随机分为模型组、卡托普利组及脑清通颗粒低、中、高剂量组，每组10只。造模成功的第2天开始给予相应药物灌胃，脑清通颗粒低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予1.3 g·kg-1、2.6 g·kg-1、5.2 g·kg-1的脑清通颗粒溶液，卡托普利组大鼠灌胃给予10 mg·kg-1的卡托普利溶液，正常组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，给药体积 10 mL·kg-1，每日1次，连续给药21 d。

2.3 大鼠动脉压测定造模前3 d用大鼠血压测量系统对大鼠进行血压测量适应性训练，以消除大鼠应激造成的血压升高。于造模前、造模第7天、造模第14天、给药第7天、给药第14天和给药第21天测量大鼠尾动脉压，每只大鼠每次测量3次，取平均值，记录平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)。

2.4 HE染色大鼠末次给药后禁食不禁水12 h，用2%戊巴比妥钠以40 mg·kg-1剂量腹腔注射麻醉大鼠。打开腹腔，腹主动脉取血后，打开胸腔，剥离剪取胸主动脉，用生理盐水冲洗，剪取1 cm用4%多聚甲醛固定，石蜡切片，脱蜡至水(依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20 min，二甲苯Ⅱ 20 min后采用梯度乙醇洗脱，最后用蒸馏水清洗)，HE染色，树脂封片，在400倍光学显微镜下观察血管内膜形态学变化。

2.5 血清AngⅡ、ET-1、eNOS、NO含量的检测严格按照试剂盒说明书操作步骤，检测大鼠血清中AngⅡ、ET-1、eNOS、NO的含量。

2.6 免疫组化检测eNOS蛋白表达水平将石蜡切片脱蜡至水后进行抗原修复以阻断内源性过氧化物酶的作用，加一抗(稀释比例为1400)4 ℃孵育过夜后，再加入与一抗相应种属的HRP标记二抗(稀释比例为1200)，室温孵育50 min，DAB显色，苏木素复染3 min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性胶封片。在400倍光学显微镜下取5个视野，应用Image J软件测定阳性表达产物的积分光密度值和阳性面积值，计算二者比值即为平均光密度值(mean optical density，MOD)，以此评估eNOS蛋白表达水平。

2.7 Western Blot检测胸主动脉组织中eNOS蛋白表达水平剪取胸主动脉约60 mg置于匀浆管中，加入10倍体积RIPA裂解液，置于均质匀浆机中匀浆，匀浆后冰浴30 min，每隔5 min震荡一次确保组织完全裂解。12 000 r·min-1离心10 min，收集上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。制作10%分离胶与5%浓缩胶，蛋白上样后进行SDS-PAGE电泳分离蛋白。300 mA恒流转膜30 min，将蛋白转至PVDF膜，使用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗(稀释比例为11 000)，4 ℃孵育过夜；取出条带，TBST洗涤3次，加入二抗(稀释比例为15 000)室温孵育30 min，TBST洗涤3次。按照ECL试剂盒说明书配制发光液，将条带显色。用PhotoShop整理去色，Alpha Innotech软件处理系统分析目标条带的光密度值。以β-actin为内参，使用Image J软件进行灰度值检测及分析。

3 结果

3.1 各组大鼠一般状态比较正常组大鼠精神良好，毛色白净、有光泽，舌质淡红，口中无痰涎，饮食及两便正常；模型组大鼠精神萎靡、易激怒，毛色晦暗、泛黄，舌质紫暗，口中多痰涎，饮食明显减少，大便秘结；给予脑清通颗粒干预后，大鼠的精神状态、毛色及舌质均有所好转，口中痰涎减少，饮食及大便逐渐恢复正常。

3.2 各组大鼠MAP的比较造模前，各组大鼠MAP无明显差异；造模后，与正常组比较，模型组大鼠MAP极显著性升高(P<0.01)；给药干预后，与模型组比较，脑清通颗粒低剂量组大鼠在给药14 d后MAP极显著性下降(P<0.01)；脑清通颗粒中、高剂量组大鼠在给药7 d后MAP极显著性下降(P<0.01)。结果表明，脑清通颗粒可降低肝热痰瘀证高血压大鼠的动脉血压。见表1。

表1 脑清通颗粒对大鼠MAP的影响

3.3 脑清通颗粒对肝热痰瘀证高血压大鼠胸主动脉血管内膜的影响HE染色显示，正常组大鼠血管内膜较光滑，结构较完整，未见明显损伤，平滑肌细胞排列较整齐；而模型组大鼠血管内膜粗糙，结构不完整，有明显脱落现象，平滑肌细胞数量明显减少；脑清通颗粒各剂量组大鼠血管内膜损伤均得到不同程度改善，表明脑清通颗粒对血管内膜有保护作用。见图1。

注：A：正常组；B：模型组；C：卡托普利组；D：脑清通颗粒低剂量组；E：脑清通颗粒中剂量组；F：脑清通颗粒高剂量组图1 各组血管内膜形态组织学比较(HE染色，×400)

3.4 脑清通颗粒对肝热痰瘀证高血压大鼠血清 ET-1、AngⅡ、NO及eNOS水平的影响与正常组比较，模型组大鼠ET-1和AngⅡ水平极显著性升高(P<0.01)，NO和eNOS水平极显著性降低(P<0.01)；与模型组比较，脑清通颗粒各治疗组 ET-1 和AngⅡ水平极显著性降低(P<0.01)，NO水平极显著性升高(P<0.01)；脑清通颗粒低剂量组eNOS水平显著性升高(P<0.05)，脑清通颗粒中、高剂量组eNOS水平极显著性升高(P<0.01)。结果表明，脑清通颗粒可降低肝热痰瘀证高血压大鼠血清中 ET-1 和AngⅡ水平，升高NO和eNOS水平。见表2。

表2 脑清通颗粒对肝热痰瘀证高血压大鼠血清ET-1、AngⅡ、NO及eNOS水平的影响

3.5 免疫组化法检测脑清通颗粒对肝热痰瘀证高血压大鼠胸主动脉eNOS的影响与正常组比较，模型组大鼠胸主动脉中eNOS蛋白表达水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较，脑清通颗粒各治疗组大鼠胸主动脉eNOS蛋白表达水平极显著升高(P<0.01)。结果表明，脑清通颗粒可提高肝热痰瘀证高血压大鼠胸主动脉eNOS的蛋白表达水平。见图2、表3。

注：A：正常组；B：模型组；C：卡托普利组；D：脑清通颗粒低剂量组；E：脑清通颗粒中剂量组；F：脑清通颗粒高剂量组图2 各组eNOS的蛋白表达比较(免疫组化染色，×400)

表3 免疫组化法检测脑清通颗粒对肝热痰瘀证大鼠胸主动脉eNOS的影响 值)

3.6 Western Blot法检测脑清通颗粒对肝热痰瘀证高血压大鼠胸主动脉eNOS蛋白表达的影响与正常组比较，模型组大鼠胸主动脉eNOS蛋白表达水平极显著性降低(P<0.01)；与模型组比较，脑清通颗粒各治疗组大鼠胸主动脉eNOS蛋白表达水平极显著性升高(P<0.01)。结果表明，脑清通颗粒可提高肝热痰瘀证高血压大鼠胸主动脉eNOS的水平。见图3、表4。

注：A：正常组；B：模型组；C：卡托普利组；D：脑清通颗粒低剂量组；E：脑清通颗粒中剂量组；F：脑清通颗粒高剂量组图3 各组eNOS蛋白表达条带图

表4 Western Blot检测各组eNOS的蛋白表达水平

4 讨论

高血压病归属于中医“眩晕”“头痛”等范畴[11-12]，病机证型繁多，尚无统一标准[13]。各医家对高血压病认识各有不同，治法各异[14-16]。《素问·阴阳应象大论》曰：“人年四十，而阴气自半也。”人至中老年易阴虚，阴虚也易致瘀，加上营养物质摄入普遍过多，体力劳动、运动等消耗性活动过少，脾失健运，痰浊内生，日久肝热血瘀痰浊互结为患，临床主要表现为头痛、眩晕、血压高、心烦急躁、大便秘结、舌质暗红、舌下可见瘀点及瘀丝等。张学文教授认为多数高血压病患者过食肥甘厚味，恣酒无度，多静少动，劳心而不劳体，加之工作或学习压力大，肝气易郁滞，日久易化热，肝热炼液为痰，痰阻则血难行，血瘀则痰难化，痰滞日久必致血瘀，血瘀内阻，久必生痰，从而表现为肝热痰瘀证高血压病[17-19]。对于肝热痰瘀证高血压病，张教授常用具有清肝活血、涤痰通络作用的脑清通颗粒治疗，肝平热清，痰去络通，血行畅顺，血压乃降。本实验通过环孢菌素A皮下注射加附子和高脂乳剂灌胃制备肝热痰瘀证高血压大鼠模型，结果发现，造模14天后大鼠血压明显升高，精神状态差，易激惹，毛色晦暗、泛黄，饮食减少，口中痰涎增多，唇舌紫暗，大便秘结，表明肝热痰瘀证高血压模型制备成功。药物治疗21 d后，各治疗组一般状态基本恢复正常，血压明显降低，说明脑清通颗粒能降低肝热痰瘀证高血压大鼠血压，使肝热血瘀证大鼠症状基本恢复正常。HE染色结果显示，经脑清通颗粒治疗后，损伤的血管内膜得到了明显改善，提示脑清通颗粒对血管内膜有保护作用。

高血压的发病机制与eNOS的活性密切相关，eNOS通过催化左旋精氨酸生成NO[20-21]。NO是由内皮细胞释放的最强血管舒张因子，可舒张动脉血管，降低血压[22-23]。ET-1是内皮细胞释放的血管收缩因子，与NO相互协调，共同调控血管的收缩舒张[24-25]。血管紧张素II(angiotensinⅡ，AngⅡ)是血管收缩因子，是RAAS系统的重要组成部分，可引起外周血管收缩和醛固酮分泌，导致血压升高[26-27]。ET-1、AngⅡ、NO三者关系密切，相互影响，ET-1促进血管平滑肌细胞释放AngⅡ，而AngⅡ又可诱导内皮细胞分泌ET-1；NO抑制ET-1的释放，从而间接抑制AngⅡ的释放[28]，相反，ET-1 的释放增多，又反过来影响NO的释放。本实验研究发现，脑清通颗粒能降低肝热痰瘀证高血压大鼠血清ET-1和AngⅡ含量，提高血清NO和eNOS的含量，提高主动脉血管eNOS的蛋白表达水平，说明脑清通颗粒可抑制肝热痰瘀证高血压大鼠血液中血管收缩因子的释放，促进血管舒张因子的释放，从而引起血压降低。

综上所述，脑清通颗粒能够保护肝热痰瘀证高血压模型大鼠血管内膜，舒张血管，降低血压，其机制可能与抑制血管收缩因子ET-1和AngⅡ的释放，促进血管舒张因子的释放，激活eNOS/NO信号通路有关。