7份枳种质耐酸碱性评价

段蓉蓉，周铮荣，韩 健，罗旭钊，马先锋，李大志，邓子牛

(1 湖南农业大学园艺学院/国家柑桔改良中心长沙分中心，长沙，410128；2 湖南省园艺研究所，长沙，410125)

柑桔作为世界第一大水果，为缩短童期和保持品种特性，在生产上多采用嫁接方式进行繁殖。砧木既影响着柑桔的抗性与适应性[1]，还影响着柑桔的生长发育、果实产量与品质等[2]。柑桔生长的最适土壤pH值范围为5.5～6.5[3]，土壤过酸或过碱都会对柑桔生长造成严重阻碍。根据全国土壤调查结果，我国土壤pH值范围在3.7～9.7，主要集中在4.5～9.0范围内，近1/3的土壤pH值在8.0～8.5之间[4]。在我国柑桔主产区中，四川和重庆等地的土壤呈碱性，其他大多数地区土壤呈酸性，其中，湖南省甜橙主产区由于长期过量施用化肥，84.6%的柑桔园土壤pH值低于4.8，最低达到了2.8，土壤酸化十分严重[5]。因此，选择和培育耐酸碱性强的砧木已经成为柑桔产业发展的重要需求。

枳Poncirustrifoliata是柑桔砧木中应用最广、综合评价最好的砧木。在我国，北到河北、山东，南至广东、广西均有枳的分布，并且在长期的栽培和自然演变过程中形成了丰富的枳属资源。枳具有很强的适应性，具有耐寒、耐酸等优点，但易感裂皮病和碎叶病[6]。枳虽耐酸，其生长适宜的pH值范围却为5.5～6.5，这制约了枳在中性或偏碱性土壤中的应用[7]，同时，土壤过酸也会对枳的生长产生不利影响，故生产上多采用枳橙或枳柚等杂种进行替代。酸橙Citrusaurantium和香橙Citrusjunons与枳同为常用柑桔砧木。酸橙根系发达，树势强，耐盐碱，耐土传病害，抗逆性强，易感衰退病[8]。香橙适宜生长的土壤pH值范围广，具有耐盐碱的特点[9-10]。

为了筛选出耐酸碱、具半矮化特性以及不易感病的优良枳种质，笔者以酸橙和香橙为耐碱对照，在温室无土栽培条件下，比较了供试7份枳种质对土壤酸碱的敏感性，并检测其在酸碱胁迫下抗柑桔溃疡病的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

从湖南省园艺研究所高桥基地、国家柑桔改良中心长沙分中心和湖南省邵阳市洞口县大田村等地采集了7份枳种质的种子，以酸橙、硬枝香橙和软枝香橙为耐碱对照。其中，洞口枳来源于湖南省邵阳市洞口县大田村，河南枳来源于中国农业科学院郑州果树研究所，富民枳、小叶枳、墨西哥飞龙枳、美国飞龙枳和变异枳均来源于湖南省园艺研究所高桥基地，硬枝香橙和软枝香橙均来源于重庆市江津区白沙镇，酸橙来源于国家柑桔改良中心长沙分中心。

1.2 方法

1.2.1 幼苗培养及处理 使用湿润毛巾包裹新鲜的成熟种子，放入温度为30 ℃、湿度为90%的恒温恒湿培养箱中催芽。当种子萌发出1 cm左右长度的主根时，选取正常发育的幼苗移栽到无菌培养土(商用育苗基质，湖南湘晖农科)中，在温度为30 ℃、湿度为60%的温室中进行培养。

当幼苗生长20 d后，选取长势基本一致的幼苗移栽至珍珠岩基质中，一株一杯(0.6 L)，幼苗分别用pH值3、6和9的1/2 MS营养液进行浇灌。营养液由1/2 MS培养基(不含糖和琼脂)粉末(杭州百思)溶于蒸馏水中配置而成，使用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液调节pH值，用pH计测定pH值。每10 d浇灌一次营养液，每次每株浇灌150 mL。每个处理9株，设置单株小区，9次重复。在酸碱处理一定时间后，测量株高、茎粗、叶片叶绿素含量，以及接种柑桔溃疡病菌(Xanthomonascitrisubsp.citri，Xcc)后测定其对柑桔溃疡病的抗性。

当幼苗生长20 d后，另外选取12～15株生长一致的幼苗，将其根部分别浸入pH值3、6和9的1/2 MS营养液中，于温室中培养24 h后，取叶样和根样测定抗氧化酶活性。

1.2.2 株高与茎粗的生长量测定 在酸碱处理第10 d、第40 d和第70 d时，分别测量植株高度(从基质表面到顶端生长点的高度)和茎粗(距离基质表面1.5 cm处主干的直径)。株高和茎粗生长量均分早期和后期，早期株高(茎粗)生长量=处理第40 d时测量值-处理第10 d时测量值，后期株高(茎粗)生长量=处理第70 d时测量值-处理第40 d时测量值。

1.2.3 叶绿素含量测定 在酸碱处理第40天时，取顶端自上而下数第2—3片完全展开叶，剪成细长条状(去除主叶脉)，称取0.1 g装入15 mL离心管中，加入95%乙醇10 mL，于黑暗中浸泡36 h(期间摇晃3～4次)后，使用酶标仪分别测定浸泡液在470、649和665 nm波长处的吸光值(A)。每处理设置3个生物学重复。测定结果计算式[11]如下：叶绿素a浓度(Ca，mg/L)=13.95A665-6.88A649，叶绿素b浓度(Cb，mg/L)= 24.96A665-7.32A649，总叶绿素浓度(Car，mg/L)=(1 000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245，样品叶绿体色素含量(mg/g)=(色素浓度×浸泡液体积×稀释倍数)/样品鲜重。

1.2.4 抗氧化酶活性测定 幼苗根部分别浸入pH值3、6和9的1/2 MS营养液中温室培养24 h后，剪取其顶端自上而下第1—3片完全展开叶，去除主叶脉后称取0.1 g，同时剪取其根尖自下而上5 cm长度根系，称取0.1 g，用液氮迅速冷冻。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定使用氮蓝四唑光化还原法，过氧化物酶(POD)活性测定使用愈创木酚法[12-13]，可溶性蛋白使用试剂盒(美仑生物)进行测定。每种处理设置3个生物学重复。

1.2.5 柑桔溃疡病抗性测定 在酸碱处理第30天时，选顶端自上而下第1—3片完全展开叶进行柑桔溃疡病菌的注射接种。使用柑桔溃疡病菌(Xcc)DL509菌系[14]，参考朱志媚等[15]的方法制备浓度为105CFU/mL的菌液，进行活体注射接种，将菌液均匀注射进叶片中，于温度为28 ℃、湿度为30%的病理温室中进行培养。在接种后8 d(8 DPI)统计单位叶面积的典型病斑数量，计算病情指数，划分病症级别。病情指数=该种质的单位面积病斑数/病斑数最多种质的单位面积病斑数。病症级别划分标准：1级(0<病情指数≤0.2)；2级(0.2<病情指数≤0.4)；3级(0.4<病情指数≤0.6)；4级(0.6<病情指数≤0.8)；5级(0.8<病情指数≤1)。

注射接种Xcc后，将材料放置在温度28 ℃、湿度30%的培养室中进行培养，分别在注射后第4天、第6天和第8天使用打孔器在叶片相同位置取一枚面积为0.277 cm2的圆片，置于1.5 mL离心管中，加入500 μL无菌水和两颗无菌小钢珠，使用磨样机将其震荡成匀浆，按100倍比例进行梯度稀释，各浓度吸取10 μL点于LB平板上，37 ℃培养48 h后统计各浓度梯度的菌落数，计算原浆液的菌量，计算单位叶面积菌含量。每个处理设置3个生物学重复。单位叶面积菌含量(CFU/cm2)=(x×50×100n-1)/0.277，x为在稀释梯度平板中的菌落数(CFU)，n为稀释梯度数。

1.3 数据分析

使用SPSS 17.0软件进行分析，采用Duncan法检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 幼苗生长发育

在相同pH值条件下，同一时期不同种质幼苗之间的株高和茎粗生长量均有显著性差异(见表1和表2)。

表1 在不同pH值处理下各柑桔砧木种质幼苗早期株高和茎粗生长量

表2 在不同pH值处理下各柑桔砧木种质幼苗后期株高和茎粗生长量

与适宜(pH值6)条件相比，酸(pH值3)处理早期(处理第10天至第40天)洞口枳、富民枳、墨西哥飞龙枳、美国飞龙枳、变异枳、硬枝香橙和酸橙的株高和茎粗生长均未受到抑制，后期(处理第40天至第70天)仅变异枳和软枝香橙的株高和茎粗生长均未受到抑制；碱(pH值9)处理早期洞口枳、富民枳、墨西哥飞龙枳、美国飞龙枳、变异枳、硬枝香橙和酸橙的株高和茎粗生长均未受到抑制，后期仅软枝香橙的株高和茎粗生长均未受到抑制。无论是酸处理还是碱处理，均是持续时间越长，抑制作用越明显(见表1、表2)。在处理第70 天时，酸处理下洞口枳、河南枳、富民枳、小叶枳和变异枳出现顶端坏死(顶端生长点坏死，且靠近顶端生长点的叶片出现点状或区域坏死)现象，飞龙枳未出现顶端坏死；碱处理下，仅河南枳出现顶端坏死(见图1)。由此可知，酸胁迫对植株生长的抑制强于碱胁迫，且更易使新梢或芽点坏死，且随着时间的推移，酸害程度逐渐加深。

图1 部分柑桔砧木种质幼苗在酸碱处理下出现顶端坏死

综上所述，洞口枳、富民枳、墨西哥飞龙枳、美国飞龙枳和变异枳能耐受短期酸碱胁迫，变异枳还能耐受较长期的酸胁迫。

2.2 幼苗叶片叶绿素含量

从处理第40天时叶片黄化情况来看，枳种质叶片对pH值变化敏感，碱处理更易使枳叶片出现黄化。其中，富民枳在pH值6处理下仍发生叶片黄化，这可能是其生长过于旺盛，而营养液提供的营养元素不足以供应其生长导致的，同时也体现出富民枳对于土壤pH值的变化十分敏感的特征(见图2)。这与处理第40天时叶绿素含量测定结果(见表3)基本一致。

图2 不同pH值处理第40天时各柑桔砧木种质叶片的黄化情况

与适宜(pH值6)条件相比，酸处理第40天时富民枳、小叶枳、硬枝香橙、软枝香橙和酸橙的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均未受到不利影响，其他种质的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均受到不利影响；碱处理第40天时富民枳、墨西哥飞龙枳、硬枝香橙、软枝香橙和酸橙的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均未受到不利影响，其他种质的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均受到不利影响。其中，河南枳、美国飞龙枳叶片叶绿素含量在酸胁迫受到的不利影响强于碱胁迫，洞口枳、小叶枳和变异枳叶片叶绿素含量在碱胁迫受到的不利影响强于酸胁迫(见表3)。

表3 不同pH值处理第40 天时各柑桔砧木种质幼苗叶片的叶绿素含量 mg/g

综上所述，富民枳幼苗叶片对酸胁迫和碱胁迫的敏感性均较低，小叶枳幼苗叶片对酸胁迫敏感性较低，墨西哥飞龙枳幼苗叶片对碱胁迫敏感性较低，河南枳、美国飞龙枳叶片对酸胁迫的敏感性高于碱胁迫，洞口枳、小叶枳和变异枳对碱胁迫的敏感性高于酸胁迫。

2.3 幼苗组织抗氧化酶活性

试验结果表明，对洞口枳而言，酸碱处理下叶片的抗氧化酶活性均显著高于pH值6处理，可溶性蛋白含量显著下降，体现出洞口枳在酸碱胁迫下叶片抗性提高。此外，小叶枳在酸处理下叶片可溶性蛋白含量显著增加、SOD活性显著提高；硬枝香橙在酸处理下出现叶片CAT活性显著下降，在碱处理下叶片SOD活性显著增加；酸橙在酸处理下出现叶片CAT活性显著增加(见表4)。

表4 在不同pH值处理下各柑桔砧木种质叶片的抗氧化酶活性

与适宜(pH值6)条件相比，洞口枳根系可溶性蛋白含量、POD活性和CAT活性在碱处理下显著增加，SOD活性在酸碱处理下均显著减少，因此推测洞口枳根系在碱性环境中可能具有较强的活性氧清除能力与抗性。此外，富民枳、小叶枳、墨西哥飞龙枳、美国飞龙枳、硬枝香橙和酸橙根系SOD活性在酸处理下显著增加，体现出其适应酸性环境的特点；美国飞龙枳、软枝香橙和酸橙根系POD活性在碱处理下显著增加(见表5)。

表5 在不同pH值处理下各柑桔砧木种质根系的抗氧化酶活性

2.4 幼苗柑桔溃疡病抗性

接种Xcc后，各种质的症状随着时间的推移逐渐加重，在第6天时绝大数种质即显现症状，在第8天时所有种质叶片的症状明显。在第8天时，酸处理下的洞口枳、小叶枳和墨西哥飞龙枳，pH值6处理下的洞口枳和富民枳，碱性处理下的河南枳、美国飞龙枳、小叶枳和变异枳，病情指数在0～0.4之间，病症级别为1～2级，感病相对较轻(见表6和表7)。

表6 在不同pH值处理下各柑桔砧木种质接种柑桔溃疡病菌(Xcc)后的症状表现

表7 在不同pH值处理下各柑桔砧木种质接种柑桔溃疡病菌后第8天的病情指数和病症级别

与适宜(pH值6)条件相比，在接菌第4天时，富民枳和小叶枳叶片菌含量在酸处理下较少，河南枳叶片菌含量在碱处理下较少；在接菌第6天和第8天时河南枳和美国飞龙枳叶片菌含量在碱处理下较少，在第8天时墨西哥飞龙枳叶片菌含量在酸处理下较少。河南枳叶片菌含量在碱处理下持续8天保持较低，这表明在碱性环境下河南枳对Xcc可能具有相对较强的抗性。总体上，酸处理下的枳种质叶片似乎比碱处理更适宜溃疡病菌的增殖(见图3)。

注：不同字母表示同一时间相同砧木不同pH值处理之间差异显著(p<0.05)。

综合叶片症状、病情指数和叶片菌含量数据进行判断，墨西哥飞龙枳在酸性环境下以及河南枳和美国飞龙枳在碱性环境下对柑桔溃疡病具有相对较强的抗性。

3 讨论

在植株生长量上，不同柑桔砧木种质之间具有明显的差异，如：河南枳和飞龙枳的生长量小，这是其种质特性所决定的，因此本试验着重比较了同一种质在不同pH值下的生长量差异，以此判断酸碱环境对其生长的影响。本试验仅对各柑桔砧木种质幼苗在酸碱短期处理下的反应进行了研究，实际生产中土壤pH值对柑桔砧木和柑桔品种的影响是长期的，因此后续研究对各砧木开展评价需要延长时间，才能得到更加全面的认识。

酸碱胁迫对柑桔砧木的生长和叶片形态的影响十分显著。大量研究证明，酸胁迫影响植物的生理生化反应，进而影响矿质养分的吸收效率[16-17]；碱胁迫也会阻碍植物养分吸收，使其生长量和叶绿素含量下降[18]。在实际生产中，香橙与酸橙的生长势大于枳，然而在本研究中，不同pH值处理下枳的生长量大于香橙和酸橙。这可能是由于本试验中的砧木材料均为实生幼苗，对于枳幼苗而言，其在垂直方向上的生长势较强，而酸橙和香橙主干较为粗壮，但生长势较弱。

植物在受到酸碱胁迫时，内部生理生化系统会受到不同程度的影响，从而产生大量活性氧(ROS)来应对胁迫，而高抗氧化酶活性则是植物增加抗逆性的重要途经[19]。同时，植物体内的可溶性蛋白大多为参与各类代谢的酶类物质，其含量在受到逆境胁迫时会发生相应的变化以应对逆境反应[20]。在本研究中，各柑桔砧木种质根和叶的可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性差异较大。值得注意的是，洞口枳在酸碱胁迫下叶片抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性和根系POD活性，碱胁迫下根系CAT活性，均相较对照(pH值6)有所增加，由此推测，洞口枳在生理生化方面对酸碱胁迫的耐性似乎强于其他种质，而关于其耐酸碱的内部机制仍需要进一步的研究。

在柑桔砧木种质耐酸碱性的评价中，还有一些其他指标可用。例如：可溶性糖是植物在逆境条件下产生的一种渗透调节物质，其浓度的高低可影响幼苗叶片的渗透势，进而影响幼苗的吸水能力；丙二醛含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度[21]；脯氨酸是一种良好的渗透调节物质，具有防止水分散失、保持细胞内外环境渗透平衡的作用，有研究表明高碱胁迫会使水稻脯氨酸浓度升高[22]。此外，在逆境胁迫时，不同植物对营养元素的吸收和积累有所不同，进而在叶片上表现出不同的受害症状，因此，研究柑桔砧木种质叶片营养元素在不同pH值条件下的积累和变化可进一步了解柑桔砧木种质耐酸碱性的差异。柑桔砧木种质的耐酸碱性是一个复杂的、受多因素影响的综合性状，评价其对酸碱胁迫的响应也是一个复杂的过程，在后续的研究中应进行更加系统全面的分析与评价。

柑桔溃疡病是由柑桔黄单胞杆菌柑桔亚种(Xcc)引起的对柑桔产业发展有巨大影响的世界性检疫病害[23]，几乎所有柑桔栽培品种感病，在寻找和培育抗病柑桔品种的同时，选育对柑桔溃疡病具有一定抗性的优良柑桔砧木则具有重大的意义。在本研究中，富民枳和小叶枳在酸处理下接种Xcc早期叶片菌含量相对较少，说明酸处理可能对Xcc侵染早期的增殖有抑制作用。不同枳种质在早期所表现出的感病差异也可能与叶片PTI免疫途径反应(激活模式诱发的免疫反应)相关，这有待进一步研究。

4 结论

实生幼苗生长早期洞口枳、富民枳、墨西哥飞龙枳、美国飞龙枳和变异枳能耐受短期酸碱胁迫，变异枳还能耐受较长期的酸胁迫。就实生幼苗叶片敏感性(叶片叶绿素含量与叶色变化)而言，富民枳对酸和碱胁迫的敏感性均较低，小叶枳幼苗叶片对酸胁迫敏感性较低，墨西哥飞龙枳幼苗叶片对碱胁迫敏感性较低，河南枳、美国飞龙枳叶片对酸胁迫的敏感性高于碱胁迫，洞口枳、小叶枳和变异枳对碱胁迫的敏感性高于酸胁迫。在抗氧化酶活性方面，洞口枳在酸和碱处理下似乎具有较强的活性氧清除能力。墨西哥飞龙枳在酸性环境下、河南枳和美国飞龙枳在碱性环境下对柑桔溃疡病具有相对较强的抗性。