梨果采后病原菌侵染机制与防控技术研究进展

赵利娜，许美秋，张晓云，杨其亚，王凯利，张红印

江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013

梨(Pyrus)属于蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)梨属植物，落叶果树，是世界上栽培面积最大的果树，也是我国的第三大水果[1]。因梨品种间没有生殖隔离，种间普遍杂交，导致种类繁多。目前，我国常见的梨种有中国豆梨(P.calleryanaDcne.)、台湾豆梨(P.koehneiSchneid.)、砂梨(P.pyrifoliaNakai.cultivar “Shuijing”)、川梨(P.betulaefoliaBunge.)、秋子梨(P.ussuriensisMax.)、白梨(P.bretschneideriRehd.)、褐梨(P.phaeocarpaRehd.)和麻梨(P.serrulataRehd.)等[2]。

梨果具有香气浓郁、风味优良、口感酥脆、水分含量高、果肉细密和果胶含量低等优良品质，深受消费者青睐。梨果加工产品同样具有重要的市场价值，如梨汁、梨酱、梨干和梨罐头等。此外，梨果因富含可溶性和不溶性膳食纤维、维生素C、钾、维生素K，以及黄酮类化合物(如花青素和黄烷醇)和酚酸(如没食子酸和绿原酸)等活性物质，被用作中药已有2 000多年的历史[3]，经常食用新鲜梨可以有效改善患有代谢综合征的老年人的血压和血管功能，改善其心脏功能[4]。据联合国粮食及农业组织统计，2020年全球梨果产量为2 310万t，我国梨果总产量高达1 610万t，位居全球第一，出口量约占世界总出口量的1/6[5]。梨果采后在自然条件下易受到病原菌的侵染，导致果肉腐烂，从而失去商品价值，制约梨果产业的健康发展[6-7]。梨果采后病害多是由病原菌侵染引起，是采后损失的最主要原因。因此，控制采后病害是保证梨果产业良好发展的必要措施。探究病原菌的侵染机制，可以为更好地开发梨果采后病害控制方法提供新思路。

1 梨果采后病害

梨果采后病害大多数是由病原真菌侵染引起，包括由Penicilliumexpansum引起的青霉病、由Botrytiscinerea引起的灰霉病、由Botryosphaeriakuwatsukai引起的环腐病、由Alternariaalternata引起的黑斑病、由Moniliniafructicola、Moniliniafructigena和Monilinialaxa引起的褐腐病等，其中青霉病占比较大。此外，少数病原细菌和卵菌也会引起梨果发生采后病害[8]。

P.expansum是一种典型的死体营养型病原真菌，通过杀死宿主细胞并从死细胞中获取营养物质来满足自身生长、发育，具有良好的适应性。P.expansum在土壤和空气中普遍存在，通常存在于果园地面以及腐烂的水果表面，可侵染多种水果[9-10]。P.expansum通过梨果的果柄、萼筒、皮孔或伤口(一部分由机械损伤引起，一部分由梨果表皮组织结构变化而引起的隐形细胞凋亡)等部位入侵，在适宜条件下，迅速向心室腐烂，并散发出刺鼻的腐烂味道[11]。Xu等[12]研究发现P.expansum通过分生孢子萌发形成芽管渗透梨果果肉组织，并分泌丝状物质最终成功侵染梨果(图1a)。B.cinerea是一种坏死性病原真菌，可侵染200多种宿主，其中包括梨果[13]。B.cinerea直接或通过伤口侵染梨果，造成梨果组织发生严重的腐烂(图1b)。通常，发病率在梨果采后贮藏6～8月时达到最高值[13-14]。B.kuwatsukai主要侵染梨果和梨树干，在果实上，引发梨果发生环腐病(图1c)，在树干上，引发树枝发生溃疡，发病期通常在采收时和采后贮藏前期[15]。A.alternata也是一种死体营养型真菌，主要危害梨树叶片和梨果，主要通过伤口侵染梨果，病斑呈现圆形或椭圆形，颜色为深棕色或黑色，果肉凹陷、软塌[16](图1d)。梨果采后褐腐病通常发生在梨果成熟阶段，主要危害梨花、芽、枝和果实，最终形成木乃伊果。同样，其主要通过伤口侵染梨果，侵染初期，梨果表面出现圆形、褐色斑点，随着侵染时间的延长，斑点从伤口向外扩散，白色菌丝扩散到梨果表面，在伤口周围形成同心圆，在适当的条件下可产生灰褐色孢子，灰褐色孢子能够传播到相邻的健康梨果，导致大量梨果腐烂，造成巨大的经济损失[17-18](图1e)。

2 梨果采后病原菌侵染机制

目前，国内外研究均集中在病原菌侵染植物的机制，有关病原菌侵染水果的机制研究尚处于起步阶段。

2.1 环境改变对病原菌侵染采后梨果的影响

梨果采后运输、销售和贮藏过程中，极易受到机械损伤形成伤口，为病原菌的侵染提供了有利的条件，病原菌可以直接入侵梨果组织，不需要先突破梨果细胞壁再进行入侵。果实成熟期是病原菌侵染的关键时期，一般来说，与未成熟果实相比，成熟果实含有的抗菌化合物相对较少，组织pH值较低，细胞壁脆弱，病原菌相关蛋白含量较高，导致其防御能力降低，更易遭受病原菌的侵染[19-20]。梨果遭受病原菌侵染时，会产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)作为主要防御屏障；与此同时，病原菌通过调节氧化应激反应成功侵染梨果[21]。

2.2 转录因子及致病相关基因在梨果采后病原菌侵染中的作用

转录因子是指与特定DNA结合的蛋白，能够调节基因表达。目前，已有研究发现部分转录因子能够调控病原菌对梨果的致病力[22]。病原菌对寄主pH值的调控是影响梨果采后病害发生和果实浸渍的重要因素。PacC转录因子对寄主的pH值具有响应性，并与P.expansum的致病力和展青霉素(patulin, PAT)合成相关。Chen等[23]研究发现在P.expansum侵染梨果时，将P.expansum中编码转录因子PacC的基因敲除后，其对梨果的致病力显著下降。编码D-葡萄糖酸的基因(GLA)通常参与宿主pH值的改变，在梨果等落叶果实中发现GLA的积累，P.expansum通过启动GLA的积累，使果实组织酸化，以便病原菌成功侵染宿主[24]。目前，关于转录因子及致病相关基因在梨果采后病原菌侵染中的功能研究相对较少。因此，本文总结了近年来报道的其他水果采后病原菌与侵染相关的转录因子及致病基因，如表1所示。

表1 水果采后病原菌中与侵染相关的转录因子及致病基因

2.3 胞外水解酶在梨果采后病原菌侵染中的作用

病原菌侵染宿主时，会分泌大量角质层酶、纤维素酶和果胶酶等(均属于胞外水解酶)，以分解果实的外部结构屏障(角质层和表皮细胞壁)，从而帮助其完成侵染[34]。木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶和果胶酶在病原菌侵染水果中起关键致病作用[35-36]。Akagi等[26]发现B.cinerea在侵染Bartlett梨果和d’Anjou梨果时，通过分泌内切多聚半乳糖醛酸酶水解梨果细胞壁中的果胶成分。当B.cinerea缺失编码内切多聚半乳糖醛酸酶的基因时，其侵染梨果的能力下降，侵染进程也相对减慢。Xu等[12]利用转录组学技术和生物信息学技术分析P.expansum侵染梨果关键时间点的基因表达情况，发现P.expansum侵染梨果过程中，通过改变编码胞外分泌蛋白酶的基因表达来完成侵染。在这些基因中，占比最大的是编码植物细胞壁降解酶的基因。但胞外水解酶在梨果采后病害中的确切作用机制尚不清楚，值得进一步研究。

2.4 真菌毒素在梨果采后病原菌侵染中的作用

真菌毒素是指在病原菌侵染采后果蔬时，产生的有害次生代谢物，部分真菌毒素与病原菌的致病性有关[37]。在梨果采后病害中，链格孢属和青霉属是最常见的真菌毒素产生菌[37]。P.expansum侵染梨果时，会分泌PAT，甚至在腐烂部分周围的健康果肉中也能检测到高浓度的PAT[38]。PAT属于聚酮类代谢物，能使不同种类动物发生急性中毒，并且PAT对细胞具有遗传毒性和免疫毒性，给人们的健康带来巨大安全隐患[39-40]。更为严重的是，PAT还存在于梨果制品中，如梨汁、梨罐头和梨酱等，给梨果及其制品的出口造成严重的影响[38]。A.alternata产生的一些有毒次级代谢物，包括交链孢酚(alternariol, AOH)、交链孢霉甲基醚(alternariol monomethyl ether, AME)、交链孢霉(altenuene, ALT)、苝衍生物交链孢毒素(perylene derivative altertoxins, ATX)和交链孢菌酮酸(tenuazonic acid, TeA)，能够介导其对宿主水果的致病力和毒力[41]。

综上所述，本文总结了目前病原菌侵染梨果的主要机制(图2)，但是其侵染机制尚不完全明确，仍需要进一步的研究。

3 梨果采后病害防治措施

目前，梨果采后病害控制方法包括化学、物理和生物3大类。一般来说，病害控制策略的有效性取决于梨果接触致病因子的潜力、侵染进程和敏感性[42]。

3.1 化学防治

3.1.1 化学杀菌剂

采前和采后使用化学杀菌剂是全球对果蔬采后病害进行防治的主流手段[43]。化学杀菌剂如氟虫腈、苯并咪唑、异菌酮、咪嗪、吡唑酯、戊唑康唑、噻苯咪唑、嘧霉胺和抑霉唑均对梨果采后病害有一定的防治效果。例如，在梨园喷洒并在采后施用苯并咪唑，可以更好地控制梨果采后灰霉病。氟虫腈是一种风险较低的化学杀菌剂，可以有效控制梨果采后青霉病和灰霉病[44]。抑霉唑(200 g/L)与嘧霉胺(200 g/L)联合施用对P.expansum、B.cinerea和A.alternata均有很好的抑制效果[45]。化学杀菌剂可能的作用机制包括抑制或减少真菌毒素的分泌、改变真菌氨基酸代谢、降低线粒体膜电位和电子传递[46-47]。

虽然化学杀菌剂具有较好的防治效果，但长期使用会使菌株产生耐药性，且农药残留会造成一定的环境安全和人体健康安全风险。已有报道显示化学杀菌剂密霉胺、抑霉唑和氟虫睛在梨果上的残留[48-49]。最近的残留分布和风险评估研究证明,梨果表面和果肉中的密霉胺、抑霉唑和氟虫睛的残留浓度符合公认标准[50]。但长期使用化学杀菌剂产生的耐药菌株和对环境的潜在危害,已是全球性的问题[51]。此外，低浓度的化学杀菌剂与拮抗酵母等生物防治剂联合使用，可有效地降低化学杀菌剂的用量，提高生物防治剂的防治效果。低剂量的噻苯咪唑和生物防治剂联合使用，与单独使用噻苯咪唑和生物防治剂相比，显著提高了梨果采后青霉病的控制效果[13]。同样，低浓度嘧霉胺也能显著提高Cryptococcuslaurentii、Rhodosporidiumpaludigenum和R.glutinis对梨果青霉病的控制效果[52]。因此，有关其他化学杀菌剂替代品的研究开发得到了越来越多的关注。

3.1.2 其他化学物质和蛋白质

随着人们对采后病害了解的加深，各种替代化学杀菌剂的物质或蛋白质已成为控制水果病害的可持续方法[19]。病原菌分泌的蛋白酶通过降解宿主细胞壁、果胶和蛋白质等结构成分并从宿主中获取营养物质。因此，通过减少病原菌分泌的蛋白酶有助于抑制病原菌的定殖和发育，最终减轻病害程度，并可能导致病原菌死亡[53]。聚半乳糖醛酸酶是病原菌产生的果胶水解酶，能够促进病原菌入侵梨果并在果实中生长[54]。梨果产生的聚半乳糖苷酶抑制剂蛋白能够抑制B.cinerea分泌聚半乳糖醛酸酶，从而有效降低梨果采后灰霉病的病害程度[55]。EDTA、氯化钙和铁载体(由R.glutinisBNM 0524产生的红酵母酸和RahnellaaquatilisBNM 0523产生的肠螯蛋白)对B.cinerea分泌的聚半乳糖醛酸酶和漆酶均具有较好的抑制效果[56]。此外，醋酸蒸汽处理梨果，能够减少梨果采后病害的发生率，但是这种方法不能长期大量使用，因为此方法对果实和制冷设备均有一定的损害作用[57]。

3.1.3 生物多糖与寡糖

生物多糖和寡糖是一些天然化学物质，可作为激发子、肥料和信号分子，诱导植物防御反应，促进植物生长和营养吸收，增强植物抗逆性，可能作为化学杀菌剂的安全替代品，并且对人类健康和环境友好[58]。大量研究表明，生物多糖与寡糖对梨果采后病害具有较好的防治效果。例如，壳聚糖和低聚壳聚糖处理梨果，能够有效降低梨果采后病原菌AlternariakikuchianaTanaka、PhysalosporapiricolaNose和Botryosphaeriasp.的侵染率，并且能够诱导提高梨果抗性相关酶，如过氧化酶(peroxidase, POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)和几丁质酶(chitinase, CHI)[59-60]。此外，牛蒡低聚果糖、β-葡聚糖、褐藻寡糖和海藻糖等天然糖类也能有效控制梨果采后病害的发生[61-65]。

3.2 物理防治

由于物理防治没有残留，且对环境友好，其在控制果蔬采后病害方面广泛应用。物理防治措施主要包括冷库、热水、热空气、微波、低压、高压和远紫外辐射(UV-C)等，以降低果蔬采后病害的发病率[66]。其中一些方法已应用于梨果采后病害的防治。梨果采后一般采用冷库贮藏，以延缓梨果成熟，防止病原菌侵染。然而，长期冷藏会导致梨果发生冷害，从而降低梨果品质，失去商品价值[67]。热处理(43 ℃)可诱导B.cinerea发生氧化损伤，抑制孢子萌发和芽管伸长，从而减轻梨果采后灰霉病的病害程度[68]。虽然物理处理对梨果采后病害有较好的控制效果，但因设备昂贵、占地面积大，目前还未能实现大规模商业化应用。此外，有些物理处理方式还会对果蔬感官品质造成负面影响[66]，需要配合其他措施保持果实品质。

3.3 生物防治

在梨果采后病害生物防治中，常用拮抗酵母和拮抗细菌作为微生物拮抗剂。细菌和酵母可以黏附在水果表面并形成生物膜，能够稳定、长期定殖，形成优势菌群，且对宿主果蔬无不良影响[69]。Meyerozymaguilliermondii能够有效抑制P.expansum的生长，且在4 ℃和20 ℃条件下，均能稳定地定殖在梨果表面[70]。Lutz等[71]发现4种拮抗酵母(C.albidusNPCC 1248、PichiamembranifaciensNPCC 1250、C.victoriaeNPCC 1263和NPCC 1259)对梨果灰霉病均有一定的控制效果，控制机制主要包括其能在梨果表面快速定殖、抑制B.cinerea孢子萌发、与B.cinerea竞争营养、分泌胞外水解酶等。此外，拮抗酵母菌可诱导梨果的抗病性，从而提高梨果对病原菌的防御能力。例如，M.guilliermondii通过诱导提高梨果组织POD、过氧化氢酶(catalase, CAT)和苯丙氨酸氨裂解酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)活性来抑制P.expansum的生长[70]。与活酵母细胞一样，酵母死体细胞也能诱导梨果的抗病性。Sun等[72]发现经过高压蒸压处理的R.paludigenum能够显著增强过氧化物酶(superoxide dismutase, SOD)、POD和PAL活性以及致病相关基因(PR1-like、endoglucanase9、endochitinase-like和PR4)的表达，从而提高梨果对P.expansum的抗病性。拮抗酵母可以增强宿主植物的抗氧化胁迫能力，从而抵御病原菌的侵染。采用M.guilliermondii处理梨果，能够减少梨果过氧化氢产量，从而减少梨果ROS的积累[73]。

芽孢杆菌属、伯克氏菌属、肠杆菌属和假单胞菌属等拮抗细菌也能有效防治梨果采后病害。作用机制主要包括与病原菌竞争空间和营养、通过铁载体抑制病原菌生长、分泌胞外水解酶和诱导梨果抗性等[74]。从梨果分离得到的Bacillussp.LYLB4能够抑制Botryosphaeriadothidea和Rhizopusstolonifer的菌丝发育，并能降低B.dothidea和R.stolonifer对梨果的致病力[75]。Aureobasidiumpullulans可以耐受宿主ROS，这对控制梨果采后病害具有重要意义[76]。

综上所述，拮抗酵母菌和拮抗细菌的生防能力依赖于其能快速增殖、快速适应宿主环境、诱导宿主抗病系统和分泌抑制病原菌生长的化合物。但微生物防治仍具有局限性，例如对已发生的侵染无效、生物安全问题和商业注册等[69]。

3.4 天然产物在梨果采后病害防治中的应用

植物提取物是天然产物的重要来源。已有研究表明植物源纯露和精油等均具有抑菌作用[77]，精油(从许多植物中提取出的芳香油性液体)是理想的替代食品防腐剂和果蔬采后病害控制剂。百里香、罗勒香和迷迭香可以降低梨果采后青霉病的发生率[78]。为了提高精油的抗菌能力和适用性，一般将其制备成乳液使用。例如，肉桂精油微乳液能够减少梨果采后灰霉病的发生率，延缓梨果抗坏血酸的流失，并且对梨果品质无不良影响[79]。金盏花纯露提取物对P.expansum具有很好的抑制效果，能够有效减少梨果采后青霉病的发生率[80]。石榴皮提取物能够有效减少鲜切梨果中Listeriamonocytogenes的生长[81]。同样，部分氨基酸(L-谷氨酸和L-赖氨酸等)通过诱导ROS代谢和抗性相关酶活性，降低梨果采后青霉病和链格孢霉病的发生率[82-83]。氨基酸的抗病能力是由其化学结构和官能团决定，Fu等[84]发现α、β、γ-氨基丁酸对梨果采后青霉病具有很好的控制效果，氨基基团的位置不同，氨基丁酸的抗病效果也不同，γ-氨基丁酸的抗病性优于其他2种化学形式。Dihydromaltophilin是来自于Lysobacterenzymogenes的一种次级代谢物，能够显著降低梨果采后炭疽病的发病率[85]。植物源提取物和其他天然代谢物的抑菌机制主要是直接抑制病原菌生长和诱导提高梨果抗病性。

3.5 综合防治

为了提高梨果采后病害防治效率，通常采用两种不同控制措施共同处理梨果。例如，钼酸铵和Candidasake共同处理梨果，与单一处理相比，显著降低了梨果采后青霉病的发病率[86]。采前使用氯化钙、福美锌和C.infirmominiatus共同处理梨果，能够显著降低梨果采后青霉病的发病率[87]。化学杀菌剂与生物防治共同处理梨果，一方面，减少了化学杀菌剂的使用量，另一方面，提高了生物防治的效率。Zhao等[65]发现0.5%β-葡聚糖可提高C.podzolicus对多糖的利用率，加快细胞壁合成、能量代谢，提高抗氧化能力，增强抗氧化应激能力和延缓衰老过程，从而提高C.podzolicus对梨果采后青霉病的控制效率。

综上所述，本文总结了目前梨果采后病害防治方法(图3)，虽然不同方式共同处理梨果可以更高效地控制梨果采后病害，但是目前尚未实现商业化应用。

4 展望

通过对梨果采后病害侵染机制以及防治方法相关文献的查找，发现国内外研究主要集中在病原菌侵染植物机制，并且取得了一定的突破，关于病原菌侵染采后果蔬的研究相对较少，尤其是关于病原菌侵染采后梨果的研究更少。随着梨果栽培面积的扩大和产量的增加，梨果采后病害的发生严重影响其商品价值和市场供应。明晰梨果采后病原菌侵染机制以及相应病害防治策略的开发已成为目前研究的热点问题。

从查阅的文献来看，梨果采后病原菌的侵染机制主要包括梨果组织环境的变化、致病相关基因的表达及转录因子的调控作用、胞外水解酶的分泌、致病相关代谢物的合成和真菌毒素的分泌。目前，化学杀菌剂仍是控制果蔬采后病害的主流手段，但考虑到其对环境和人类健康的影响，亟须开发新的控制方法。因效率低、价格高和空间限制等问题，大多数已开发替代化学杀菌剂的控制方法尚未实现商业化。对病原菌侵染梨果机制的研究将有助于开发更安全、有效的防治方法。在现有研究的基础上，还要努力做好以下几个方面：①对病原菌侵染采后梨果的机制进行进一步探究，挖掘更多与侵染相关的致病因子；②研究采后梨果响应病原菌的抗性机制，挖掘抗病因子，以及探索其与致病因子相互间的作用关系；③根据病原菌与采后梨果的互作机制相关研究结果，分别从病原菌和梨果出发，开发可替代化学杀菌剂的安全、高效的防治方法，例如，利用分子生物学技术表达梨果的抗性相关基因，以此来提高梨果自身抗病性，延长贮藏期；④对梨果表面微生物群落进行研究，探索不同微生物间的相互关系，以此开发新的防治方法，从而提高经济效益，使得我国梨果产业经济能够健康发展。