无花果乳浆石油醚萃取产物对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用

李保宏，李忠原，刘苗苗，倪雯婷，尹怡铭，赵方舒，田景振，张晓平,3*，崔清华

（1.山东中医药大学药学院，山东济南 250355）（2.山东中医药大学中医药创新研究院，山东济南 250355）（3.山东中医药大学青岛中医药科学院，山东青岛 266112）

我国是糖尿病发病率较高的国家，糖尿病可造成组织炎症、病理损伤和多种心血管疾病[1,2]，而高糖是糖尿病微血管病变的关键因素之一[3]。高浓度葡萄糖及其有毒的副产物，如晚期糖基化终末产物（AGEs）等，会导致糖尿病患者大血管和微血管的内皮功能障碍，包括细胞通透性增加、细胞凋亡、糖萼破裂，造成机体氧化应激和细胞因子分泌异常等[4]，高血糖导致的异常生成的新血管通常是未成熟的，并在视网膜病变中起病理作用，导致玻璃体出血和纤维化，这也是引起糖尿病大血管并发症的始动环节[5]。

无花果乳浆是桑科榕属药食两用植物无花果（Ficus caricaL.）的鲜果和茎秆挤出的乳白色粘稠乳汁，是一种在植物特殊分泌细胞中发现的复杂分子混合物的水悬浮液，可以合成和储存相当数量的不同次生代谢物，如含有有机酸、脂肪酸、三萜类化合物、类固醇、蛋白质和氨基酸等[6,7]。无花果乳浆部分来自于无花果，在化学成分和功能上具有一定相似性，无花果作为药食两用的植物果实，主要含有黄酮、香豆素、甾醇和三萜类等化合物[8]，其各部位在治疗皮肤病、抗肿瘤、免疫调节、抗菌等方面具有突出效果，中医记载无花果可治疗便秘，作为泻药，治疗痢疾和肠炎[9]，现代研究[10]显示可抑制结直肠癌、乳腺癌、肝癌等及肿瘤血管形成；无花果叶提取物可通过刺激胰腺β细胞产生胰岛素，降低2型糖尿病大鼠的血糖和血脂[11]，也可抑制VEGF-A的mRNA表达水平[12]；无花果乳浆在民间可治疣[13,14]。但截止目前，无花果乳浆对糖尿病微血管作用效果的基础研究较少，本研究从微血管生理角度，探究无花果乳浆对于高糖诱导血管内皮细胞的损伤保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜采摘于广西玉林的无花果乳浆（批号：20210901）；胰蛋白酶（不含EDTA）（货号：25200056）、胎牛血清（FBS）（货号：16140071）、磷酸缓冲液（PBS），美国Gibco公司；Transwell侵袭小室（批号：351157）、Martigel基质胶（批号：256234），美国康宁公司；ECM培养基，美国Sciencell公司；Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒（批号：556547），美国BD公司；SOD（货号：ml063052）、LDH（货号：ml024518）、NO（货号：ml022390）ELISA试剂盒，上海酶联生物；VEGF（货号：C18013036）、ET-1（货号：C19013037）、eNOs（货号：C13013038）ELISA试剂盒，武汉华美生物；Huvec人脐静脉血管内皮细胞（ATCC CRL-1730）购自普诺赛，在质量分数5%ECM完全培养基中传代培养；其余试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

N-1100旋转蒸发仪，东京理化器械株式会社；SCIENTZ-10N冷冻干燥机，宁波新芝生物；safe-1200TE生物安全柜，上海力新仪器公司；HF90二氧化碳培养箱，上海力新仪器公司；Spectra Max M5酶标仪，美国分子仪器公司；CKX41倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；Accuri C6流式细胞仪，美国BD公司。

1.3 无花果乳浆的萃取分离

取广西夏季（九月）新鲜采集的无花果挤出乳浆混悬液，经山东中医药大学中医药创新研究院崔清华副教授鉴定确认，取新鲜收集的无花果乳浆，在磁力搅拌器作用下，缓慢多次地搅拌加入无水乙醇，使其体积分数达60%，4 ℃静置24 h，使用10层纱布过滤，抽滤，收集上清液和沉淀。所得上清液，按前述步骤搅拌加入无水乙醇至体系醇浓度达90%，4 ℃静置24 h，抽滤，上清液旋转蒸发至无醇味，分别按1:1（V/V）比例加入石油醚、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇进行系统溶剂萃取，充分振摇后静置分层，旋转蒸发至无溶剂残留，冷冻干燥得固体。

1.4 MTT法测定供试品对Huvec细胞高糖模型的增殖影响

取烘干的无水葡萄糖溶于PBS中，配制成75 mmol/L的葡萄糖溶液，超滤除菌，加入ECM培养基中配制成高糖培养基（葡萄糖含量为35 mmol/L），将不同极性萃取部位固体使用DMSO溶解，再稀释于高糖（35 mmol/L）低血清培养基中（含质量分数0.5% DMSO），供试品起始浓度为3 mg/mL，2倍比连续稀释8次，终浓度为23.44 mg/L，共得8个浓度梯度。

取10代以内的Huvec细胞，胰酶消化后铺于96孔板内（每孔1×105个细胞），孵育过夜。每孔加入100 μL含供试品高糖（35 mmol/L）低血清培养基，每个浓度设3个复孔，设置高糖模型组（35 mmol/L）和正常对照组（5.5 mmol/L），均含有质量分数0.5%DMSO。37 ℃，5% CO2孵育48 h，每孔加入MTT溶液120 μL，37 ℃孵育4 h，加入DMSO溶液100 μL，570 nm处观察吸光度值（OD），计算细胞存活率（实验组OD值与正常对照组OD值的比值）。

1.5 “划痕试验”考察供试品对Huvec高糖模型的迁移影响

将Huvec接种在6孔板中（每孔3×105个细胞），使用枪头尖划痕，PBS清洗，每孔加入含供试品高糖低血清培养基，每个浓度设置3个复孔，设置高糖模型组和正常对照组，在0、24、48 h用倒置显微镜在事先标记的固定位置拍照，以0 h划痕面积作为参照，使用ImageJ软件计算迁移率（观察时刻与0时的面积差与0时面积的比值）。

1.6 Transwell侵袭试验考察供试品对Huvec高糖模型的侵袭影响

采用24孔、8 μm孔径的Transwell板，每孔加入100 μL基质胶，37 ℃孵育1 h后，胰酶消化Huvec，用低血清高糖培养基重悬细胞至每毫升1.5×105个细胞，上室加入200 μL细胞悬液，下室加入含供试品高糖培养基溶液750 μL，高糖模型组下室加入不含供试品的高糖完全培养基，正常对照组下室加入低糖完全培养基。孵育48 h后，4%甲醛、甲醇固定，0.1%结晶紫染色，倒放在显微镜下拍摄，使用ImageJ软件计算侵袭率（结晶紫染色面积与小室面积比值）。

1.7 血管形成试验

将枪头和96孔板4 ℃预冷，每孔加入50 μL Matrigel基质胶，37 ℃孵育1 h。每孔接种Huvec（4×105个），加入100 μL含供试品高糖低血清培养基，设置高糖模型组和正常对照组，孵育6 h后，用倒置显微镜观察成管情况。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡

胰酶消化Huvec，接种在六孔板内（每孔3×105个细胞），每孔加入含供试品高糖培养基，设置高糖模型组和正常对照组，孵育48 h后，使用不含EDTA的胰酶消化，按照说明书加入Annexin V-FITC、PI染液，1 h内在流式细胞仪中检测。

1.9 酶联免疫吸附法（ELISA）测定供试品对Huvec高糖模型中VEGF、ET-1、SOD、LDH、NO、eNOs因子的影响

胰酶消化Huvec，接种在6孔板内（每孔3×105个细胞），每孔加入含供试品高糖培养基，设置高糖模型组和正常对照组。孵育48 h后，取超滤后细胞上清液，-20 ℃保存备用。严格按照ELISA试剂盒说明书进行测定。

1.10 统计学处理

实验数据采用Graphpad Prism 8进行处理，每次结果至少包含3次样本，数据以平均值±标准误差表示，组间两两比较采用独立t检验，多组间比较采用多因素方差分析和LSD-t检验，p＜0.05认为具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 供试品对Huvec高糖模型的增殖影响

与正常对照组相比，高糖环境可使Huvec细胞存活率显著下降至76.04%（p＜0.001）。在各萃取产物中，只有石油醚可以对高糖环境下的Huvec细胞起到较显著的保护作用。石油醚萃取产物在750 mg/L及以下浓度时均可显著提高细胞活力至约100%（p＜0.05），维持高糖环境下的细胞活性，结果见图1。此外，石油醚萃取产物在750 mg/L浓度时细胞存活率为93.85%，此浓度以下无明显的细胞毒性，结果见图2。故以下试验采用无花果乳浆石油醚萃取产物（质量浓度分别为400、200、100 mg/L）作为供试品。

图1 不同浓度无花果乳浆石油醚萃取产物对Huvec高糖模型增殖的影响Fig.1 Effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on the proliferation of Huvec cells with high glucose

图2 不同浓度无花果乳浆石油醚萃取产物对Huvec细胞毒性Fig.2 Cytotoxicity of petroleum ether extract of Ficus carica latex to Huvec cells

2.2 供试品对Huvec高糖模型的迁移影响

细胞划痕实验可以反应细胞的转移生长能力，通过显微图像和Image J量化分析，在24 h内，正常对照组Huvec细胞迁移率为40.26%，高糖模型组的细胞迁移率明显下降至28.36%（p＜0.01），在48 h内，正常对照组Huvec细胞迁移率为55.47%，高糖模型组的细胞迁移率显著下降至32.39%（p＜0.001）；与高糖模型组相比，在24 h和48 h内无花果乳浆石油醚萃取产物具有较好的保护作用（p＜0.001），24 h时，100、200、400 mg/L浓度时迁移率分别为44.73%、51.08%、42.12%，48 h时，100、200、400 mg/L浓度时迁移率分别为61.01%、66.30%、46.40%。随着无花果乳浆石油醚萃取产物浓度增高，促迁移效果略有下降，推测可能与轻微的细胞毒性有关，结果见图3、图4。

图3 显微镜观察无花果乳浆石油醚萃取产物对Huvec高糖模型的迁移影响（×40）Fig.3 Micrographs of the migration effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on Huvec cells with high glucose(×40)

图4 无花果乳浆石油醚萃取产物对Huvec高糖模型的迁移率Fig.4 Effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on the migration rate of Huvec cells with high glucose

2.3 供试品对Huvec高糖模型的侵袭影响

图5 显微镜观察无花果乳浆石油醚萃取产物对Huvec高糖模型的侵袭影响（×200）Fig.5 Micrographs of the invasion effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on Huvec cells with high glucose(×200)

图6 无花果乳浆石油醚萃取产物对Huvec高糖模型的侵袭率Fig.6 Effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on the invasion rate of Huvec cells with high glucose

细胞侵袭试验可以反应细胞的侵袭转移能力，通过显微图像和Image J量化分析发现，相较于正常对照组，高糖模型组侵袭细胞数显著减少至22.09%（p＜0.001），100、200、400 mg/L无花果乳浆石油醚萃取产物可分别显著提高细胞侵袭率至36.63%、38.42%、38.75%（p＜0.001），结果见图5、图6。

2.4 供试品对Huvec高糖模型血管形成能力的影响

将Huvec细胞接种在基质胶上，可在体外模拟血管的体内形成。相比于正常对照组，高糖模型组显著降低了Huvec细胞的血管形成能力，血管形成不连贯，变细，管状数目变少。而无花果乳浆石油醚萃取产物可以呈剂量依赖性的提高血管形成的能力，保护因高糖受损的模拟血管，防止其形成中断，形成表观形状规则的管状集合体，数量增多，结果见图7。

图7 显微镜观察无花果乳浆石油醚萃取产物对Huvec高糖模型血管形成能力的影响（×100）Fig.7 Micrographs of the effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on the angiogenesis of Huvec cells with high glucose (×100)

图8 无花果乳浆石油醚萃取产物对Huvec高糖模型凋亡影响Fig.8 Effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on apoptosis of Huvec cells with high glucose

2.5 供试品对Huvec高糖模型凋亡的影响

图9 无花果乳浆石油醚萃取产物对Huvec高糖模型的凋亡率Fig.9 Apoptosis rate of petroleum ether extract of Ficus carica latex on Huvec cells with high glucose

细胞凋亡异常可能导致病理状态，细胞凋亡是内皮保护的重要因素，它的发展直接关系到内皮损伤的程度[15]。高糖环境下导致ROS的增加，可以触发JNK的激活，最终介导Caspase-3诱导的内皮细胞凋亡[16]，此外，内皮细胞还可以通过ET-1途径增加线粒体ROS的产生，促进细胞凋亡[17,18]。与正常对照组相比，高糖模型组凋亡的细胞数显著性提升，达到24.23%（p＜0.001），说明高糖环境促使了Huvec细胞凋亡。100、200、400 mg/L无花果石油醚萃取产物均可显著性抑制Huvec细胞凋亡，凋亡率分别为15.37%、12.96%、14.96%（p＜0.001），其中200 mg/L的保护效果最佳，不同浓度之间差异较小，结果见图8、图9。

2.6 供试品对Huvec高糖模型中相关因子的影响

图10 无花果乳浆石油醚萃取产物对Huvec高糖模型的因子影响Fig.10 Effect of petroleum ether extract of Ficus carica latex on the factors of Huvec cells with high glucose

高糖环境所致细胞损伤是血管内皮功能障碍的重要原因，LDH是一种稳定的细胞质酶，细胞受到损伤后，膜内LDH会不可逆地渗漏到周围介质中，是细胞膜完整性和活力遭到破坏的重要标志之一[19]，可反映细胞膜的损伤程度。SOD作为重要的抗氧化酶，被认为是抵抗ROS的第一线防御系统，能通过清除ROS来保护细胞免受损伤，2001年，Brownlee提出了“糖尿病并发症的共同机制”理论[20]，认为过量产生超氧化物和活性氧（ROS）会导致高血糖的血管内皮损伤，在糖尿病并发症的发生机制中起着关键作用。

血管内皮细胞合成多种蛋白因子参与微血管的生理功能调控，ET-1是目前发现最强的缩血管活性物质，可调节人体血管微循环[21]，血管内皮细胞产生的NO是重要的保护性因子，具有舒张血管，抑制平滑肌增生，避免血管管腔狭窄的作用，正常情况下ET-1/NO处于一种动态的平衡状态[22]。在糖尿病模型中，胰岛素和生长因子受体酪氨酸激酶结合后，激活PI3K通路，进而激活eNOs，生成NO[23,24]。然而，高糖环境减少人内皮细胞产生NO[25]，AGEs减少eNOS表达并使NO失活，由于氧化应激和AGEs的产生降低了NO的生物利用度[26,27]，有研究表明，eNOs的缺乏增加了小鼠足细胞的损伤，加速了糖尿病肾病的进展[28]。VEGF是一种强效的促血管生成因子，与受体结合后，可增加血管通透性，促进血管内皮细胞生长，糖尿病患者和啮齿动物肾脏中VEGF表达上调和下调均有报道。通常，高血糖和AGEs通过减少血管内皮细胞上VEGFR2受体的表达影响VEGF生成，造成VEGF过度积累，并导致血管内皮细胞对血管内皮生长因子的反应性降低，造成内皮细胞功能障碍，在体内VEGF的上调可能是有害的，但也可能是代偿性的[29-31]。

与正常对照组相比，高糖模型组的乳酸脱氢酶（LDH）、血管内皮生长因子（VEGF）和内皮素-1（ET-1）因子水平分别显著性提高至20.96 μg/L、90.03 ng/L、839.41 ng/L（p＜0.01），超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）和内皮型一氧化氮合酶（eNOs）含量分别显著性下降至3.52 μg/L、184.75 μmol/L、0.59 IU/mL（p＜0.01）。100、200、400 mg/L石油醚萃取产物均可分别显著性降低LDH至19.73、19.29、15.80 μg/L、分别降低ET-1至465.05、343.74、146.58 ng/L、分别提高NO水平至200.89、226.25、232.55 μmol/L（p＜0.05），200、400 mg/L浓度时可以分别显著降低VEGF含量至28.19、31.66 ng/L（p＜0.01），400 mg/L浓度时可明显提高eNOs含量至1.12 IU/mL（p＜0.001）和SOD水平至15.80 μg/L（p＜0.01），结果见图10。

3 结论

综上所述，本研究发现高糖模型在体外可以显著性阻碍Huvec人脐静脉内皮细胞的正常生理功能，如增殖、迁移、侵袭和血管形成，并促进细胞凋亡，无花果乳浆的石油醚萃取产物可明显改善上述功能，抑制细胞凋亡。高糖环境下可导致细胞受损和生理因子分泌紊乱，具体表现为上清液中LDH显著增高，SOD显著降低，VEGF和ET-1显著增高，NO和eNOs显著降低。无花果乳浆的石油醚萃取产物可以减轻细胞损伤，可能通过恢复正常的血管相关因子水平，保护内皮细胞正常生理功能，防止微血管发生病变。然而，无花果乳浆物质基础并不明确，本研究也只考察了高糖和无花果乳浆对Huvec细胞的体外作用，在体内经过复杂的代谢和生化反应则可能得到不同的结果，所以下一步将进行体内实验验证本研究所得结论，进一步支持其作为药食两用植物的基础研究和开发应用。