湖羊繁殖性状的调控机制研究进展

张艳丽,郭佳禾,姚晓磊,王锋

(南京农业大学动物科技学院/湖羊研究院,江苏 南京 210095)

中国羊存栏量约3亿只,居世界第一,其中绵羊占50% 以上,以肉用为主,大多分布于北方及中原肉羊产业带,主要以放牧和散养为主,存在单胎繁殖率低、效益不高等问题。近些年,随着生态环境保护和肉羊养殖向规模化、舍饲化方向快速发展,对肉羊繁殖性能提出了更高要求。湖羊是中国特有的多羔绵羊品种,以 “全年发情、繁殖率高、耐粗饲、宜舍饲”而著称[1]。湖羊羔皮曾是我国传统的出口创汇商品,在国际裘皮市场上享有盛誉,被称为中国的“软宝石”。随着市场需求改变,市场对羔皮的需求逐渐转向对羊肉的需求。近几年,湖羊已被引种到全国各地,在我国北方出现了大量的规模化湖羊养殖场。据统计,湖羊每胎平均产活羔数为2.29,产羔率达 200%～250%,其中产单羔的占17.10%,产双羔的占41.90%,产三羔的占33.60%,产四羔的占6.50%[2]。繁殖性状是一个极其复杂的性状,受遗传、饲养管理和营养等多因素调控,导致湖羊繁殖性状形成的机制仍不明晰,迫切需要进行深入探究,为高繁绵羊的选育提供技术与理论支撑。

1 湖羊繁殖性状的分子调控机制

动物繁殖性状的调控机制复杂,但卵巢的排卵性能与子宫的容受性是公认的2个主要控制环节,其中卵泡发育及排卵发生主要受下丘脑-垂体-卵巢轴协调控制。动物是否多胎,卵巢多排卵是前提,但能否正常妊娠,还要看子宫的容受性和发育状况。目前,已有较多研究鉴定了肉羊繁殖性状相关候选基因(表1)。此外,本团队发现,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在湖羊初情期发生、激素分泌、卵巢功能、精子发生等生殖活动中也发挥重要的调控作用。如:LncRNA CERNA调控Smad2(SMAD家族成员2)进而影响卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)的分泌;LncRNA FDNCR通过调控DCN/TGF-β通路促进湖羊颗粒细胞的凋亡;LncRNA3662通过WNT6调控WNT/β-catenin信号通路引起湖羊子宫内膜上皮细胞的增殖凋亡进而影响子宫内膜容受性;LOC105611671 通过FGF9影响睾丸分泌睾酮(图1)。

表1 湖羊繁殖性状相关候选基因Table 1 Candidate genes related to reproductive traits of Hu sheep

图1 非编码RNA在湖羊垂体、卵巢、子宫及睾丸功能中的调控作用Fig.1 Functional regulatory network of non-coding RNA in pituitary,ovary,uterus and testis of Hu sheep

1.1 多胎湖羊下丘脑-垂体系统的分子调控

下丘脑能够接收体内、外环境变化的信号,调节促性腺激素释放激素的分泌,从而调控性腺活动。垂体分泌的FSH和LH是调控家畜生殖活动和繁殖力的关键激素。高繁殖力湖羊外周血浆中FSH和LH平均浓度均显著高于低繁殖力湖羊,进一步转录组学分析发现,单、多羔湖羊下丘脑组织中存在56个差异表达基因,并与器官发育、信号传导和转录调控等生物学过程密切关联,可通过神经信号传递通路、γ-氨基丁酸信号通路参与调控排卵及卵泡发育等过程[16]。

为探究lncRNA在高、低繁殖力湖羊垂体中的调控作用,王锋教授团队以高繁湖羊卵泡期和黄体期的垂体组织为研究对象,通过转录组测序(RNA-seq)鉴定到144个差异表达lncRNA和557个差异mRNA,其中lncRNA XR_001039544.4定位于湖羊垂体细胞的细胞质中,敲低后显著抑制湖羊垂体细胞的增殖及LH分泌,并提示其可能作为竞争性内源性RNA来调节LHB[17]。同时,在高、低繁殖力的湖羊垂体中筛选到了298个差异mRNA和57个差异lncRNA,其中lncRNA MSTRG.259847.2可能通过顺式作用调控靶基因Smad2并且影响FSH和LH的分泌[18]。以上结果表明,lncRNA通过调控垂体功能进而影响湖羊的繁殖力,但具体机制还需要进一步探究。

1.2 多胎湖羊卵巢功能的分子调控

湖羊的多胎性与卵泡发生、发育关系密切,特别是与优势卵泡的数量直接相关。卵泡发生、发育是一个极为复杂的过程,需经历募集、选择和优势化3个阶段[19],最终大部分卵泡发生闭锁,只有极少数发育为优势卵泡而排卵。

1.2.1 湖羊卵泡发育及排卵的调控机制在绵羊上,自从发现BMPR-1B(骨形态发生蛋白受体1B)基因突变即FecB基因与多胎表型完全一致的特征后[20],BMP家族在绵羊卵巢卵泡发育方面的研究备受关注。BMP属于TGF-β超家族成员,其信号从细胞膜转导至细胞核是由Smad蛋白家族介导的。BMP作为Smad上游调控元件,BMP及其受体是引起级联反应的先决条件。已证实,BMP/Smad信号通路在调控绵羊卵泡发育和排卵过程中扮演着重要角色[21]。其中FecB基因最显著的生理效应是能显著增加母羊卵巢上的排卵数,且具有加性效应:即纯合基因型(FecBB)比杂合型基因型(FecB+)具有更高的排卵率[22]。因此,育种工作者已将FecB基因作为一种多胎候选基因广泛应用到多胎绵羊的选育工作中。湖羊是世界上少有的几个携带FecB基因的绵羊品种,该基因已成为多胎性的重要标志[23]。然而,在实际生产中,许多携带纯合FecB基因的湖羊仍存在产单羔的现象,这种现象的产生说明FecB与多胎性之间可能存在着更精细的调控机制,也提示进一步挖掘与湖羊卵巢卵泡发育及排卵相关标记基因的必要性。

目前已成功鉴定了多个与绵羊排卵相关的主效基因,如BMPR-1B、BMP15[5]、GDF9[6]、Woodlands[23]和B4GALNT2等[24],但尚未系统揭示湖羊的多胎机制。高通量测序技术的发展为深入研究湖羊卵巢功能及排卵提供了基础。本团队以发情期高、低繁殖力湖羊不同大小健康卵泡为研究对象,进行RNA-seq后发现,CITED4(Cbp/p300与Glu/Asp富羧基末端结构域4相互作用的转激活子)和PGR(孕酮受体)基因在高繁殖力湖羊大于5 mm卵泡中的表达水平显著高于低繁殖力湖羊[7,25]。体外研究发现,LH能够上调湖羊颗粒细胞中CITED4基因和排卵相关基因(AREG、EREG、PTGS2)的表达水平,过表达CITED4基因不仅能够显著提高颗粒细胞对LH的敏感性,也能促进湖羊颗粒细胞的增殖和激素的分泌[25]。INHBA(抑制素A亚基)基因可通过调节湖羊颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌,进而影响卵泡发育[8]。因此,INHBA、PGR和CITED4基因可能通过影响卵泡发育进而调控湖羊的繁殖力,但具体机制还需要进一步验证。

1.2.2 表观遗传修饰对湖羊卵巢功能的调控表观遗传修饰主要包括非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)和DNA甲基化等[26-27]。已证实,表观遗传修饰在哺乳动物多种生物学过程中起着关键调控作用,包括发育、生长、繁殖、疾病等多方面[28-32]。目前ncRNA的研究主要集中在lncRNA和微小RNA(microRNA,miRNA)。其中,在繁殖领域,表观遗传修饰参与精子发生[33-34]、卵巢卵泡发育[35]、睾丸发育[36-37]和胚胎发育[38-39]的调节,这为探究湖羊多胎机制提供了契机。

如上所述,由于多胎性与卵泡发生发育密切相关,尤其与排卵优势卵泡的数量直接相关[40]。为揭示ncRNA在绵羊繁殖力调控中的作用,研究者以多胎小尾寒羊和单胎陶赛特羊卵巢为研究对象,RNA-seq分析发现10个差异 miRNA[41],同时,lncRNA可能通过调控TGF-β和催产素信号通路相关基因的表达影响绵羊繁殖力[42-43]。本团队以不同繁殖力的湖羊卵巢为研究对象,采用RNA-seq技术获得了5个与繁殖力相关的差异lncRNA[44];同时采用WGBS技术绘制了不同繁殖力湖羊卵巢的DNA甲基化图谱[45]。Yao等[9]以不同繁殖力、不同基因型(FecBB和FecB+)的湖羊卵巢为模型,发现lncRNA FDNCR在低繁FecB+湖羊卵巢中高表达,且通过miR-543-3p/DCN/TGF-β通路促进湖羊颗粒细胞凋亡。Samina等[46]以不同月龄湖羊卵巢组织为研究对象,利用RNA-seq测序技术鉴定到330个差异表达miRNA,37 309个差异 lncRNA,并富集到细胞周期、TGF-β、PI3K-AKT等通路。解领丽等[47]分别以1月龄和8月龄湖羊卵巢为研究对象,也获得一定数量的差异miRNA。以上研究说明ncRNA和DNA甲基化在调节绵羊多胎性方面起着重要作用。

虽然有关ncRNA在调节绵羊繁殖力方面的研究取得部分进展,但仍存在较大的局限性,还需进一步探究其作用机制。一方面,采用基因组重测序及全基因组关联分析并结合蛋白质组学、代谢组学等多组学联合分析方法进行深入的功能验证，是未来进一步挖掘影响卵巢功能和排卵的基因调控网络的趋势;另一方面,前期研究大多数是以卵巢为研究对象,不仅造成不同大小卵泡转录本混合,导致筛选有价值lncRNA和miRNA受限,而且不能将关键lncRNA和miRNA与相应大小的卵泡对应起来,无法精准揭示肉羊多胎性的调控机制。因此,进一步以不同繁殖力湖羊和不同大小健康卵泡为研究对象,对其进行横向和纵向比较,将为后续深入探究ncRNA参与调控湖羊多胎机制提供支撑。

1.3 多胎湖羊子宫容受性的分子调控

在卵巢功能及高排卵数的前提下,胚胎成活率及流产率决定了湖羊能否多胎。因此,湖羊子宫发育与子宫容受性与繁殖效率密切相关。湖羊子宫容量相对较大,能容纳更多胎儿,子宫腺体、子叶与微血管发育丰富,能提高营养物质转运,有利于提高胚胎存活率与产仔数[48]。因此,从子宫容受性方面探究不同繁殖力湖羊的产羔差异对于提高湖羊的繁殖性能具有重要的意义。

1.3.1 湖羊子宫表型与繁殖力的关系研究显示,妊娠第43天的湖羊子宫质量、子宫内膜腺体直径、子叶干物质含量及微血管密度等指标显著高于低繁殖力的新疆细毛羊[49]。Gao等[50]对不同繁殖力湖羊子宫组织形态学进行研究,发现高繁组湖羊子宫内膜腺体(UGs)密度与微血管密度(MVD)显著高于低繁组湖羊,子宫系数和侵入型子宫腺体数目则显著高于低繁组湖羊。子宫腺具有内分泌与旁分泌的功能,能够产生前列腺素、葡萄糖及氨基转运蛋白、半乳凝素15、胰岛素样生长因子等促进胚胎着床的物质[51]。研究发现,子宫腺敲除羊(UKO)的胚胎不能正常着床与附植,提示子宫腺的发育及功能对子宫容受性有显著影响[52]。

1.3.2 湖羊子宫容受性基因的调控网络研究显示,高繁殖力湖羊子宫腺体发育相关基因HOXA10、HOXA11、IGF-1、VEGFA及LGR5等表达水平显著高于低繁殖力湖羊[10]。进一步运用RNA-seq技术对不同繁殖力湖羊子宫内膜差异表达基因进行富集,发现其主要富集在NF-κB、TGF-β、WNT、Hippo等与子宫发育和功能调节相关的信号通路。对WNT信号通路中的关键基因WNT6进行体外类器官功能验证,发现WNT6基因可能通过WNT/β-catenin信号通路调控子宫内膜上皮细胞的增殖,并且促进3D培养子宫内膜细胞中子宫腺的形成[51]。

为进一步研究ncRNA对湖羊子宫机能的调控机制,王锋教授团队以不同繁殖力的湖羊子宫内膜为研究对象,采用RNA-seq技术共鉴定到数百个差异表达的lncRNA,主要富集于雌激素、NF-κB、催产素和WNT等与子宫内膜功能相关的信号通路;同时,lncRNA3662通过海绵吸附miR-1576,促进子宫内膜上皮细胞的增殖、迁移和生长因子的表达,上调WNT6表达,进而激活WNT/β-catenin通路[11](图1)。

1.4 湖羊睾丸发育和精子发生的分子调控

王丹[53]发现RFRP-3基因在8月龄湖羊睾丸中的表达水平较10日龄及4月龄湖羊显著上升。安世钰等[54]以3月龄及9月龄湖羊睾丸为研究对象,发现PPARGC1A/NEF1/TFAM通路核心基因参与睾丸细胞的增殖和分化,进而促进睾丸的生长和发育。Li等[12]研究发现SPATA6基因在湖羊睾丸中高表达,定位于睾丸间质细胞的细胞质和细胞核,参与睾酮合成,提示SPATA6基因是调控精子发生的一个重要功能分子。杜丹丹[13]在湖羊睾丸的精原细胞、精母细胞、精子细胞以及间质细胞中检测到Kiss1和GPR54阳性反应产物,发现60～120日龄湖羊睾丸组织中Kiss1和GPR54基因相对表达量与睾丸质量、睾丸体积显著相关,说明Kiss1/GPR54可能在初情期启动、睾丸发育和精子发生过程中发挥重要作用。孙武[55]对 6月龄湖羊进行全基因组重测序,并与睾丸大小及衍生性状开展GWAS,筛选到194个显著相关的SNP,结果提示THEG、APOL3、PATZI、POU5F1等可能是调控湖羊睾丸大小的候选基因,可以作为分子辅助标记,用于绵羊分子育种。罗静[56]对不同发育阶段的湖羊睾丸测序发现了11个SNP对睾丸重等睾丸相关指标有显著影响,其中SNP1、SNP10、SNP13可以作为分子选择的潜在标记。

同时,睾丸功能还受ncRNA调控。Yang等[14]对5日龄、3月龄、9月龄、2岁不同年龄湖羊睾丸进行RNA-seq测序,构建了lncRNA-mRNA调控网络,发现了5个lncRNA及其靶基因PRKCD、NANOS3、SERPINA5和CYP19A1在精子发生和雄性生殖腺发育信号通路中富集,为进一步研究lncRNA在绵羊睾丸发育和精子发生过程中的作用提供了参考。Gao等[57]发现lncRNA(LOC105611671)可以作为竞争性内源RNA吸附miR-26a,调节FGF9基因的表达水平,促进湖羊睾酮生成。

2 湖羊繁殖性状的营养调控机制

繁殖性状除受到基因、表观遗传修饰等要素的调控,营养因素在繁殖性状调控中同样发挥着重要的作用[58-59]。高效精准的营养调控对于提高湖羊的繁殖性能具有重要意义。

2.1 营养调控对湖羊卵泡发育的影响

营养水平会影响绵羊黄体期的卵泡发育。研究发现随着营养水平的提高,卵巢中直径≥3.5 mm的卵泡数量显著增加,直径2.5～3.5 mm卵泡的数量显著降低,平均发情周期缩短[60];而黄体期限饲延长了母羊的发情周期,显著减少了直径≥2.5 mm卵泡的数量[15],表明黄体期补充营养能促进卵泡发育并提高排卵率。限饲显著增加直径≥2.5 mm卵泡中E2水平和类固醇生成相关基因的表达水平,同时显著降低颗粒细胞中FSHR(促卵泡素受体)和细胞增殖相关基因的表达[61];而补充精氨酸(Arg)通过调节卵巢中关键NO/PGC-1α信号通路基因的表达,加速了排卵进程和提高发情率[62]。对黄体期饲喂不同营养水平绵羊的颗粒细胞进行测序,发现PTGS2(前列腺素合成酶2)、UCP2(解偶联蛋白2)和StAR(调节蛋白)等基因表达均随着营养改善而上调[63]。郭云霞[63]以黄体期短期优饲绵羊不同时期的下丘脑、垂体、卵巢组织为研究对象,RNA-seq测序发现其富集于钙离子、MAPK、胰岛素、孕酮介导的卵母细胞成熟等信号通路,并从中筛选到一批与繁殖相关的基因(AGRP、LEPR、PRL)。

2.2 营养调控对湖羊子宫及胎盘发育的影响

胎儿宫内生长受限(IUGR)不仅阻碍胎儿生长发育,影响动物初生体重,而且与出生后的高发病率和死亡率密切相关,并造成家畜养殖业的巨大损失。母羊胚胎或胎儿死亡主要发生在妊娠早期识别、受精卵附植、胎盘的发育等阶段,其中妊娠早期受精卵在子宫内附植、胎盘形成及生长发育是胎儿程序化发育的关键时期,此阶段对繁殖母羊受胎率和胎儿生长发育的影响非常大。

研究L-Arg对营养限制湖羊子宫内膜微血管的影响,发现营养限制显著增加了湖羊子宫MVD(甲羟戊酸5)以及血管生成生长因子的表达水平,但补充L-Arg抵消了营养限制对MVD及血管生成生长因子的影响,表明L-Arg在维持子宫内膜 MVD和血管生成生长因子的平衡时具有关键作用[64]。在此基础上,研究发现绵羊子宫内膜中ERα/β和PGR表达水平因营养限制而显著增高,但L-Arg抵消了营养限制对ERβ和PGR表达的影响。在体外试验中,低浓度L-Arg处理子宫内膜上皮细胞会引起ERα表达水平的显著增加,但高浓度L-Arg又会降低子宫内膜上皮细胞ERβ和PGR的水平,该结果表明L-Arg在调节子宫内膜中的类固醇激素受体表达中也具有关键作用,为后续研究子宫内膜和子宫内膜微血管的发育提供了参考[65]。

胎盘具有物质交换、防御、合成和免疫等功能,对维持正常的妊娠具有重要作用。因此,饲料营养水平可能通过影响胎盘正常生理功能进而对母羊的繁殖性能产生影响。有研究表明能量限制会影响母羊胎盘发育,同时影响肉阜和子叶组织中mTOR通路关键因子p70S6K和4EBP1蛋白及其磷酸化蛋白表达水平,而在限饲母羊日粮中补充N-氨甲酰谷氨酸(NCG)和过瘤胃保护的L-精氨酸(RP-Arg)能够影响母体内分泌状况,提高母羊胎盘抗氧化能力,调节子叶和肉阜中血管生长相关因子以及mTOR通路中关键因子的表达,促进妊娠早期至晚期的胎儿和胎盘发育[66]。

2.3 营养调控对湖羊睾丸发育的影响

营养水平对雄性绵羊睾丸发育与精子发生也发挥着重要调控作用。营养水平可通过改变睾丸重和激素水平,影响睾丸的正常生理功能,进而影响精子质量。能量平衡是精子正常发生的重要保障,通过研究能量限饲和补偿的青春期前公羊睾丸发育的生理影响,发现能量限饲会降低羔羊的睾丸重和精子数量,15%和30%的能量限饲通过激活AMPK-ULK1信号通路诱导羔羊睾丸自噬和凋亡,能量补偿可以挽救因限饲而造成的睾丸损伤[67]。王震等[68]对不同能量限饲和补偿后羔羊睾丸发育、血清生殖激素变化规律进行分析,发现能量限饲可显著降低睾丸总重、睾丸比重和血液睾酮激素浓度,补饲能恢复或缓解前期能量不足引起的繁殖性能下降。

3 湖羊产业发展的问题与展望

母羊种质资源已成为制约养羊业高效、可持续发展和实现国家养羊业发展模式战略转变的瓶颈问题。湖羊种羊长期处于供不应求的状态,作为国宝级的珍贵品种资源还面临着杂种羊的威胁,如湖羊基因混杂、种羊纯度不高等;同时湖羊生产企业的“重扩繁、轻培育”思想也严重制约着湖羊的可持续发展[69]。

3.1 湖羊的保护和评价不足,需要建立湖羊核心种质性能测定和评价机构

湖羊保护已迫在眉睫,原产地活体保种是最有效的保种手段,但国内外受重视的生物技术保种尚未建立,也没有种羊性能测定与评价机构和可以共享的种质资源数据库。因此亟需在原产地活体保种的基础上,加大生物技术保种投入,包括精液、卵子冷冻保存、胚胎冷冻保存和细胞冷冻保护等。近几年,虽然湖羊养殖规模化、集约化程度越来越高,但对遗传资源保护和评价的重视程度不够,没有摸清湖羊种质资源家底。伴随着“湖羊”全国热,保种场和扩繁场均出售种羊,同时存在“炒种”现象,影响肉羊生产者的积极性,也使优质的湖羊种质资源遭到破坏。因此需要建立种质性能测定与评价体系及机构,并建立湖羊核心种质资源数据库,创新更优秀的湖羊新品系。

3.2 湖羊优质性状的分子解析不深,需要开展湖羊优质性状功能基因挖掘与精准鉴定

湖羊优质性状形成机制的解析不足,特别是其高繁性状形成的分子机制研究深度不够,如对子宫受容性的认识不足,迄今尚未发现FecB之外的其他有效分子标记,从而影响现代分子育种技术的应用。繁殖性状是肉羊重要的经济性状之一,但该性状属于限性表达的低遗传力性状,运用常规方法进行育种选择的进展缓慢。运用分子生物技术,寻找控制产羔数的主效基因或与之紧密连锁的分子标记,对提高肉羊繁殖性能具有十分重要的意义;进一步利用高通量多组学测序技术开展湖羊特色优质性状的相关基因的挖掘、筛选与鉴定,将为湖羊种质资源的创新利用提供有力支撑。

3.3 湖羊育种关键技术的开发利用不够,需要开发高通量智能化性能测定与高效繁殖新技术

近年来,江浙沪地区的高繁湖羊被大量引入到新疆、内蒙、甘肃等(西)北方省区,用于多胎新品系的培育和舍饲养殖,在低繁殖力绵羊品种遗传改良中发挥了巨大作用。由于湖羊“外引”需求较大,优秀种湖羊流失严重,核心种羊质量出现下滑,加之多数种羊场“重扩群、轻选育”思想泛滥,造成湖羊的一些优良种质特性逐渐退化。此外,湖羊优质性状的开发利用不足,影响养殖效益,饲养企业为了追求经济效益,无计划地引进外来绵羊与湖羊杂交,使得湖羊优良基因混杂,造成湖羊群体基因组成和遗传特性发生改变,严重制约着湖羊产业的可持续发展。近年来,湖羊育种技术研究和应用虽取得了较大的进步,但仍受持续的支持和企业自主创新动力不强等不利因素困扰,导致湖羊育种关键技术研发进展缓慢。目前尚未建立起具有精准表型的大规模参考群体,性能测定技术手段也相对落后,高通量智能化性能测定技术的研发投入不足,严重影响测定效率和准确性并影响测定数据质量;高效繁殖技术尚未全面推广应用,优秀种羊的遗传潜能难以充分发挥,导致遗传育种进展缓慢。

综上,繁殖力是制约肉羊产业发展的关键因素之一。湖羊作为国宝级的高繁品种,推动其持续选育,加强湖羊的保护、评价和利用,确保湖羊供种能力和质量,对改良我国低繁殖力绵羊品种的繁殖性能、促进养殖户和农民增收、早日实现国家羊业发展模式战略转型具有重要意义。

致谢:感谢陆奇、蔡玉、杨花、李晓丹、马健宇等参与本综述材料的收集及整理工作。